3.5 B. abortusT淋巴细胞的凋亡不依赖于PGE2的分泌
由于前列腺素如PGE2能有效的调节T细胞的活性，我们推测，他们可能参与了B. abortus.诱导的细胞凋亡。为了验证，用B.abortus.感染T淋巴细胞，48小时后，用RIA检测PGE2的水平。如图5A所示，B. abortus.感染使得PGE2分泌显著增加。接下来，我们在吲哚美辛存在或缺乏的情况下感染T淋巴细胞48小时，抑制前列腺素的产生。Annexin V检测凋亡。在PGE2缺乏的情况下，不影响B. abortus对T淋巴细胞的诱导凋亡（图5B）。结果表明，PGE2不参与诱导T淋巴细胞的凋亡。
3.6 TNF-a有助于L-OMP19调节T淋巴细胞的凋亡
考虑到TNF-a是T淋巴细胞凋亡的一个调解子，当用TLR2配体刺激细胞时，T淋巴细胞可以分泌这种因子。我们决定调查TNF-a是否参与B. abortus 和 L-Omp19, 两个 TLR2 l配体引起的细胞凋亡。首先，用不同MOI的B.abortus感染T淋巴细胞，48h，6天后用ELISA分别检测TNF-a的浓度。如图6A，感染后TNF-a的分泌明显增加。这种因子的产生在48h增加，6天略有下降。L-OMP19也诱导剂量依赖于TNF- a的分泌。正如预期的那样，U-OMP19不能产生这个结果(图6B)。接着 ，在中和性抗-TNF-a抗体存在的情况下或者其他的同类型的作为对照，用L-omp19孵育T淋巴细胞。48小时后，用Annexin Vassay检测凋亡细胞。中和TNF-a的L-OMP19诱导的细胞凋亡显著下降（图6C）。总而言之，这些结果表明B. abortus 和 L -Omp1 9都能诱导T淋巴细胞分泌TNF-α和诱导这种细胞因子介导的细胞凋亡。
4 讨论
B.abortus作为一种慢性和持久的进化成功的病原体依赖于它以各种不同的方式逃避宿主细胞的免疫反应。先前，我们证明了，感染B. abortus能够下调MHC-II的表达和对人类巨噬细胞的抗原呈递。这一策略可以被视为躲胞内持续感染巨噬细胞，从而间接的阻碍T淋巴细胞的反应。然而，B. abortus也可以利用其他的手段操纵宿主细胞的免疫反应，通过直接的攻击它的主要靶细胞，T淋巴细胞。在这项研究中，我们评估了这种可能性。具体来说，我们调查了B. abortus是否能够调节T淋巴细胞的生存。
首先我们问B. abortus是否能够感染这类细胞。我们提出了证据，B. abortus无法以一种有效的方式感染T淋巴细胞。事实上，观察到不仅入侵的水平大大低于THP-1细胞，而且细菌也不能在T淋巴细胞内复制。这似乎并不奇怪，如果我们已经确定，吞噬细胞是细菌在宿主细胞内的优先复制细胞，尽管它也能够感染其他的非吞噬细胞类型。可能，T淋巴细胞中不包含合适的吞噬器官或者布鲁氏菌复制形成液泡足够的细胞环境。
虽然T淋巴细胞的入侵是非常低和非复制的，我们证明了B.abortus能够以一种独立的APC方式诱导T淋巴细胞的凋亡。这一结果引发了一个问题，细菌是如何在巨噬细胞内生存的，以及以一种直接的方式与T淋巴细胞作用的。已经确定，在布鲁氏菌感染过程中的某些时期，细菌的接种物是如此之高，局部防御机制是无法遏制感染，因此，这些微生物可以到达血液而导致菌血症。菌血症不仅发生在急性布鲁氏菌患病者而且也发生在慢性布鲁氏菌病患者复发时期。因此，当细菌位于细胞外的T淋巴细胞环境时，可以与T淋巴细胞直接作用。
本研究是第一次描述，在没有APCs作用下，B. abortus可以直接调节T淋巴细胞。但是，也有证据表明，该机制也可用于其他病原体。例如，分支杆菌肺结核，另一种细胞内细菌，通过直接干扰近端的TCR信号，可以抑制活化的CD4＋T淋巴细胞，细胞壁的糖脂结构部件参与了此现象。同样，其他病原体如疱疹病毒家族也能够抑制TCR信号近端。
Annexin V的凋亡也通过使用TUNEL分析法得到证实。Annexin V分析法可以检测早期的凋亡，这可能不是朝着晚期凋亡恢复到正常的状态，因此，过高的估计了凋亡的细胞数目。同时，TUNEL法检测DNA片段化，即晚期凋亡。不过，用这两种技术我们已取得了类似的百分比凋亡细胞，这可能表明大部分的T淋巴细胞在感染B.abortus过程中都经历从早期凋亡到晚期凋亡的过程。
近日，Skendros等审阅了细胞免疫反应，可以解释Th-1缺陷的免疫反应和T细胞在慢性布鲁氏菌病患者中的无效性。一些最相关的数据表明慢性布鲁氏菌病患者呈现出减少了周围CD4+ CD25+ T淋巴细胞与CD4/ CD8的比例。此外，与急性布鲁氏菌病患者相比，来自慢性布鲁氏菌病患者的PBMCs表现为低增生性反应和针对特定布鲁氏菌抗原的TH1细胞因子产生有所下降。特别是，在慢性布鲁氏菌病患者的PHA的缺陷的T细胞增殖反应与CD4+子集相关。在另一项研究中，来自于慢性布鲁氏菌病患者中的T淋巴细胞显示出减少了CD69早期活化标志的表达。此外，用长时间患病的全血培养HKBA的特征在于CD3+IFN-γ+T细胞显著减少。我们的结果表明，B. abortus能诱导T细胞的凋亡，也表明CD4+T细胞与CD8+T细胞更易于导致细胞凋亡，与这些研究结果相一致。不仅如此，至少部分的也可以解释，所有这些临床证据可以改变慢性布鲁氏菌病患者的T细胞反应。
凋亡被描述为一个活跃的，自主的细胞拆除编程过程，避免引发炎症。因为细胞凋亡被看作一个稳定的控制过程，其发生在特定的传染过程，引起了很大的关注。先前描述的多种病原体已成为导致凋亡的特征细胞死亡。Kremer等已经表明，在C57BL/6小鼠体内有丝分裂后体外T淋巴细胞增殖缺陷或TCR刺激都将导致CD4+和CD8+T淋巴细胞凋亡增多更易感染牛结核分枝杆菌BCG。此外，其他病原体，如莱姆病螺旋体，单核细胞增生李斯特氏菌，沙眼衣原体和肺炎链球菌也能诱导T淋巴细胞的凋亡无论是以直接或间接（从感染
的巨噬细胞内）的方式。因此，T淋巴细胞的凋亡在建立感染和随后病原体的生存中发挥重要作用。
B. abortus诱导的凋亡不依赖于细菌的生存能力，因为HKBA也能产生同样的效应。此外，这一结果表明，有一种细菌结构元件参与了此反应。在这项研究中，我们已经证明，B. abortus外膜脂蛋白就是导致T淋巴细胞凋亡的元件。L -Omp19，一个典型的B. abortus脂蛋白，在整个细菌中概括的诱导T淋巴细胞的凋亡。相反，U- Omp19没有这样的效果，表明，OMP19的酰化反应是其生物活性所必需的。不仅L-Omp19而且Pam3Cys都能诱导T淋巴细胞的凋亡。由于所有的布鲁氏菌的脂蛋白都被类似Pam3cys所修饰，相比于其他的脂蛋白都能产生这样的效果。我们的研究结果，B. abortus的脂蛋白对T淋巴细胞的促凋亡的能力，与Aliprantis等人研究的TLR2介导的细胞活性，用其转染HEK293细胞，观察到细菌的脂蛋白/脂肽有促凋亡的性能的结果相一致。如之前所述，伯氏疏螺旋体脂化的脂蛋白ISPA 和OSPC能诱导T淋巴细胞凋亡。此外，在我们的实验室，我们展示了布鲁氏菌脂蛋白在星形胶质细胞中的促凋亡特性。总之，这些结果表明，在不同的细胞类型中细菌脂蛋白能诱导细胞凋亡。前列腺素是一种强有力的免疫调节剂，特别是T淋巴细胞。如先前所述，PGE2不仅能抑制T细胞的增殖，而且对T淋巴细胞的凋亡也有很大的影响。Chattopadhyay等表明肿瘤分泌物PGE2能下调IL-2受体的表达，因此抑制CD4+T细胞的生存。在这里我们表明，感染B. abortus能诱导T淋巴细胞分泌PGE2.然而，PGE2不参与T淋巴细胞的凋亡，因为阻止了前列腺素的产生而吲哚美辛对此没有影响。PGE2在感染期间分泌有另一个目的，例如抑制T细胞的增殖或促炎症性细胞因子的产生。
TNF-a是T淋巴细胞促凋亡的细胞因子。此外，有证据表明，结核分枝杆菌和感染沙眼衣原体的巨噬细胞通过分泌TNF-a能诱导T淋巴细胞的凋亡。尽管巨噬细胞不包括在我们所研究的内容中，但当用TLR2配体刺激时，CD4+T淋巴细胞有分泌TNF- a的能力。在我们的研究中，我们提出B. abortus能诱导TNF-a调节T淋巴细胞的凋亡。用B. abortus或者L-Omp19刺激T淋巴细胞能诱导TNF- a的产生。此外，L-Omp19诱导的凋亡在中和抗-TNF- a抗体存在的情况下可以恢复。这些结果表明TNF- a参与了诱导T淋巴细胞的凋亡。
总而言之，我们的结果表明，B. abortus通过它的脂蛋白和TNF-a的分泌的方式诱导T淋巴细胞的凋亡，一种新的机制强调了这种病原体有利于调节宿主免疫反应的能力。这可以被认为是一个新的B.abortus靶向T淋巴细胞的逃避策略，各种临床证据也可以解释在慢性布鲁氏菌病患者中B. abortus改变了细胞的功能。