项目名称： 植物重要器官形成的遗传和表观遗传调
起止年限：依托部门：控机理研究
曹晓风 中国科学院遗传与发育生物学
研究所
2009.1至2013.8 教育部 中国科学院
首席科学家：
一、研究内容
作为植物发育生物学中的最重要领域，植物器官形成的研究已成为植物科学中的重要前沿和新的增长点。本项目瞄准这一科学前沿，以保证我国粮食安全的重大需求为导向，采用分子遗传学、表观遗传学、细胞生物学、生物化学和系统生物学等多学科综合研究手段，解析高等植物重要器官形成和大小决定的遗传与表观遗传调控机制和网络，重点阐明器官形成过程中形态建成关键因子的作用机理和信号网络。针对要解决的科学问题，我们将从植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络、植物重要器官形态建成的调控机制和模型以及重要植物器官大小控制的分子基础三个方面系统研究器官形态建成的分子机制，为实现对植物生长发育调控的遗传改良提供理论依据。其中，这三个课题之间具有内在的联系，花器官决定是花器官发育的前提，而两者均对器官和种子的大小有一定的影响。 1、植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络
植物器官特征决定受一些关键基因控制，这些基因受到转录、转录后和翻译后等多种水平精细调节。花器官决定是植物从营养生长向生殖发育转变的重要发育过程，并产生花器官。长期以来调控植物开花的分子机制一直是植物发育生物学研究的热点。植物开花时间不仅影响作物的穗数和粒数，还影响生长周期和环境适应性等，是决定作物产量和品质的重要因素之一。赤霉素和自主途径因子是植物自身发育进程调控开花的关键因素，但是对赤霉素如何启动植物开花的了解却非常有限，而表观遗传调控因子在哪些通路、通过哪些靶位点调控开花关键基因还不清楚。赤霉素和自主途径因子如何接受环境信号通过植物自身发育进程来协调开花调控的目前还知之甚少。本项目将从花器官决定入手，综合利用遗传学、细胞生物学、生物化学、蛋白组学以及表观遗传学等手段，通过鉴定参与赤霉素和自主途径的遗传和表观遗传调控因子、解析这些遗传因子之间在各自的途径和与其它途径间相互作用的分子机制、研究表观遗传调控因子通过哪些靶位点调控各种遗传因子，解析各种激素和环境因素如何参与调控植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络。我们将开展以下三个方面的研究：
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1) 赤霉素调控植物开花的分子机制研究。揭示短日照条件下早花突变体的作用机理，初步建立赤霉素促进开花的遗传途径。
赤霉素在植物开花调控中起着重要的作用，拟南芥赤霉素生物合成途径缺失突变体ga1，在短日照条件下不能开花，在拟南芥ga1-3突变体的背景下，敲除赤霉素信号传导重要元件DELLA蛋白，如：ga1-3 gai-t6 rga-t2 三缺失突变体在短日照条件下可以正常开花，表明赤霉素可以通过依赖于DELLA蛋白的GA信号传导途径参与拟南芥短日照开花的调控。化学抑制剂Paclobutrazol（PAC）处理植物能够阻遏赤霉素合成。spy是在含PAC培养基上筛选出的拟南芥突变体。rga spy gal-3三突变体表型分析表明SPY能够增强DELLA蛋白的作用。spy编码的SPINDY蛋白与动物的O连的N-乙酰葡萄糖胺转移酶（O-GlcNAc）高度同源，同野生型相比，敲除SPINDY，植物开花的关键调控因子，如：CO，SOC1和FT等基因转录水平都提高。表明赤霉素还可以通过依赖于SPINDY蛋白途径参与拟南芥短日照开花的调控。赤霉素是通过哪些重要因子和途径启动植物开花的？赤霉素与自主通路因子是如何接受环境信号，并通过植物自身发育进程来协调开花调控的？SPINDY是否是整合赤霉素和光信号（光周期和节律）网路调控植物由营养生长到生殖发育转化的关键节点也有待进一步深入探讨。本项目将重点鉴定SPINDY参与的开花调控的遗传途径中的新成员，并通过这些新成员的互作蛋白研究它们对植物花器官决定的作用机制以及赤霉素与植物环境信号互作调控花器官分化的机理。具体内容包括： (1) 利用pSPY:SPY-GFP的拟南芥转基因材料，通过EMS化学诱变和遗传筛选，
获得Paclobutrazol抗性并抑制ga1-t表型的早花pef 突变体和抑制spy3表型的晚花ros突变体。比较ga1-t ros，ga1-t和ga1-t pef突变体间开花时间及开花相关基因的表达差异，进而推测ROS和PEF在调控开花机制中的可能功能。
(2) ROS和PEF基因克隆，分析基因表达模式和抗体制备。分析ROS和PEF
对SPINDY或者DELLA蛋白功能的影响。
(3) 通过酵母杂交和免疫共沉淀分析可能与DELLA蛋白质相互作用的蛋白DIP
（或基因），深入探讨DIF在植物开花调控中的功能，重点分析这些新成分
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在控制植物开花中的功能，揭示赤霉素调控植物开花的分子机制。 2) 蛋白质复合体对开花关键基因表达调控的分子机制研究。鉴定蛋白质复合体组分，重点阐述蛋白质复合体对开花关键基因表达调控的分子机制。 前期研究已经表明SPINDY基因可以调控CO基因的表达。进一步的CHIP实验分析表明CO位点染色质区域被修饰，而且这种修饰与SPINDY蛋白相关。酵母双杂交的研究结果也表明SPINDY蛋白可与GI蛋白质相互作用，那么是否SPINDY蛋白通过影响开花关键基因的染色质区域修饰相关的蛋白质复合体形成或组成，进而调控植物由营养生长到生殖发育关键基因的转录？拟南芥PICKLE（PKL）基因可能编码一种CHD3染色质重塑因子，该基因突变具有晚花表型，而PKL如何通过蛋白质互作、或者通过染色质水平调控重要开花基因的启动子来影响其中某个位点的组蛋白的修饰，需要进一步的实验证据。在这里我们将重点鉴定SPINDY和PICKLE的互作蛋白及蛋白复合体，并研究它们是否通过影响蛋白修饰或者染色质重塑在染色质层面调控开花的分子机理。具体内容包括：
(1) 通过GI-TAP和SPY-TAP转基因材料，利用生物化学和蛋白质组学分析手
段，鉴定SPINDY蛋白质复合体新组分。
(2) 分析T-DNA插入突变体表型，明确SPINDY蛋白对蛋白质复合体形成以
及蛋白质复合体形成对关键开花基因染色质修饰的影响，揭示这些新组分对关键开花基因表观遗传调控的分子机制。
(3) 通过蛋白质免疫共沉淀和酵母双杂交分析，分析PICKLE的互作蛋白及蛋
白复合体；并将pkl与hac1突变体进行比较，利用ChIP方法分析PKL结合于开花调控因子启动子区域的染色质状态，探讨PKL与HAC1、FLC和LFY在功能上的关系。
3) 蛋白质翻译后修饰调控植物开花过程的表观遗传信号网络研究。解析多种
组蛋白翻译后修饰调控植物开花的遗传和表观遗传机理，阐明自主通路感应自身发育进程的信号促进植物开花的机理。
蛋白质翻译后需要进一步修饰方能行使其生物学功能（包括蛋白质的甲基
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化、乙酰化、糖基化、磷酸化以及泛素化等），这些修饰影响着几乎所有的生命过程，研究表明开花发育不仅受遗传调控，在表观遗传学水平上也受到更为精细的调控。其中，拟南芥中蛋白精氨酸甲基转移酶(AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT4a/b等)和组蛋白乙酰转移酶AtHAC1都参与了FLC介导的开花调控过程，但是精氨酸甲基化如何在不同组织、不同发育阶段以及在不同条件下的特异底物仍然是个未知数，这些甲基化信号是如何被读取和传导的？甲基化和乙酰化修饰之间的相互作用关系是什么？AtPRMT10蛋白是以二聚体形式存在，能自身甲基化，该蛋白质自身翻译后修饰是如何被调节的？它们又是通过哪些靶基因调控拟南芥开花过程的？对上述问题的回答将解析多种组蛋白翻译后修饰调控植物开花的遗传和表观遗传机理，阐明自主通路感应自身发育进程的信号促进植物开花的机理。本项目将重点鉴定AtPRMT5、AtPRMT10和AtPRMT 4a/b的互作蛋白及蛋白复合体，了解它们是通过修饰哪些因子、通过何种分子机理调控拟南芥开花的。具体内容包括：
(1) 在基因组水平上，利用Solexa大规模测序技术，比较野生型Col和atprmt5
突变体基因的表达模式，重点分析mRNA可变剪切的变化及其对开花的调控机理。
(2) 构建atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b突变体之间的双、三突变体和与
athac1等自主通路突变体之间的多突变体，研究这些基因与拟南芥开花自主通路突变体的遗传关系。
(3) 通过蛋白质免疫共沉淀和酵母双杂交分析，鉴定AtPRMT5、AtPRMT10
和AtPRMT 4a/b的互作蛋白及蛋白复合体，在体内外验证这些互作蛋白参与调控拟南芥开花的遗传网络。利用定点突变技术，鉴定参与AtPRMT10蛋白二聚体形成和自身甲基化位点，利用遗传学手段研究AtPRMT10自身翻译后修饰调控开花的机理。
(4) 利用亲和层析，寻找能够特异识别对称性和非对称性双甲基化的精氨酸残
基的蛋白，阐明这些甲基化信号是如何被读取和传导以调节拟南芥开花的。
(5) 结合蛋白双向电泳和精氨酸甲基化特异性抗体等分析手段，比较野生型
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