三、研究方案
实现项目五年预期目标的总体研究思路：
主要作物的产量是由单位面积有效穗、每穗粒数、千粒重三个基本要素决定的，而这三要素主要由开花时间、花器官发育和种子大小等器官形成相关的发育生物学因素决定的。因此，本项目将针对上述科学问题，从植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络、植物重要器官形态建成的调控机制和模型以及重要植物器官大小控制的分子基础三个方面系统研究器官形态建成的分子机制，为实现对植物生长发育调控的遗传改良提供理论依据。其中，这三个课题之间具有内在的联系，花器官决定是花器官发育的前提，而两者均对器官和种子的大小有一定的影响，
实现项目五年预期目标的技术路线：
本项目以拟南芥和水稻为主要材料，利用遗传学、生物化学、细胞生物学和全基因组学研究手段，重点采用突变体筛选和鉴定，分离和克隆控制突变体表型的关键基因并对克隆的基因进行功能验证，利用细胞学和分子生物手段、突变体间的遗传杂交分析研究功能基因间的相互作用关系；通过蛋白质修饰和互作检测技术以及DNA与蛋白质互作全基因组分析技术研究蛋白与蛋白互作或者基因与蛋白互作，整合植物器官决定、形成和大小的遗传与表观遗传调控网络，初步阐明器官形态建成的分子机理，为实现对植物生长发育调控的遗传改良提供理论依据。
本项目实现预期目标的可行性：
(1) 资源优势：水稻和拟南芥的基因组测序已完成，功能基因组和蛋白组学的平
台建设已逐步完善。拥有一大批与本项目有关的拟南芥和水稻器官发育相关的突变体，已克隆了一些重要的功能基因，项目实施过程中通过相互作用蛋白或者蛋白与基因的互作的高通量筛选，又可获得大量新的有用材料，为项目的实施提供了保障。
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(2) 研究优势：植物器官形成及调控机制的研究已有一定的研究基础。本项目的
研究内容是建立在已有的工作基础之上，各个研究组已具备了较好的研究基础和条件，在突变体筛选、ChIP分析、生化分析、显微操作和免疫荧光定位技术等都是项目组有关成员多年来经常采用的技术。相关的工作已有多篇论文在国际权威刊物上公开发表。所取得的成果已经证明我们在该领域具有较强的国际竞争力，特别是目前研究团队内良好的学术氛围，完全可以保证本项目的顺利实施。
(3) 人才优势：项目组主要成员有多年从事植物遗传学、表观遗传学和生物化学
研究经验，已在Nature、PNAS、Plant Cell、EMBO Reports和Plant Physiology等国际重要刊物上发表多篇相关的论文，这为深入开展植物重要器官形成的遗传和表观遗传分子机理的研究奠定了良好的科学和人才基础。同时本项目在已有优势人才的基础上，围绕关键科学目标进一步优化了现有队伍，建立起优势互补、联合攻关的协作团队。
本项目的创新性和特色
(1) 科学问题的前沿性：本项目以我国粮食安全重大需求为导向，瞄准国际科学
前沿，凝练研究目标，集中开展重要农艺性状（产量）相关的分子基础研究，揭示控制植物重要器官形成的调控机理，发掘鉴定一系列在植物重要器官发生、形态建成、器官大小控制过程中起关键作用的遗传因子和非编码RNA，建立遗传与表观遗传相互作用调控植物重要器官发生和形态建成的理论和模型，阐明作物重要产量性状决定的分子基础。
(2) 研究方法的先进性：综合运用分子遗传学、表观遗传学、细胞生物学、生物
化学和系统生物学等多学科交叉研究方法，结合最新的小分子RNA、转录因子调控靶标基因的全基因组分析技术等，从基因转录调控、转录后调控、蛋白翻译后调控三个层次对控制植物重要器官形态建成的遗传与表观遗传网络开展系统性的研究。
(3) 研究体系的独特性：项目所涉及的研究材料(拟南芥和水稻等)，既有模式植
物的有利特点，使研究技术和途径易于实施、保证了研究的深度和水平，又
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与农业生产目标紧密结合，使研究结果产生直接的农业效益。另外，发育生物学研究很大程度上依赖于重要研究价值的突变体材料的获得，本项目的研究团队已具备了大量工作积累，获得了一批与植物器官形态建成相关的重要突变体，为进一步深入研究植物器官特征决定、形态建成、大小控制等奠定了坚实的工作基础。
课题设置
课题1、植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络
设置思路：植物器官特征决定受一些关键基因控制，这些基因受到转录、转录后和翻译后等多种水平精细调节。花器官决定是植物从营养生长向生殖发育转变的重要发育过程，并产生花器官。长期以来调控植物开花的分子机制一直是植物发育生物学研究的热点。赤霉素和自主途径因子是植物自身发育进程调控开花的关键因素，但是对赤霉素如何启动植物开花的了解却非常有限，而表观遗传调控因子在哪些通路、通过哪些靶位点调控开花关键基因还不清楚。赤霉素和自主途径因子如何接受环境信号通过植物自身发育进程来协调开花调控的目前还知之甚少。
研究内容：本课题将从花器官决定入手，通过鉴定参与赤霉素和自主途径的遗传和表观遗传调控因子、解析这些遗传因子之间在各自的途径和与其它途径间相互作用的分子机制、研究表观遗传调控因子通过哪些靶位点调控各种遗传因子，解析各种激素和环境因素如何参与调控植物器官特征决定的遗传和表观遗传调控网络。我们将开展以下三个方面的研究：
1) 赤霉素调控植物开花的分子机制研究。揭示短日照条件下早花突变体的作用
机理，初步建立赤霉素促进开花的遗传途径。具体内容包括：
(1) 利用pSPY:SPY-GFP的拟南芥转基因材料，通过EMS化学诱变和遗传筛
选，获得Paclobutrazol抗性并抑制ga1-t表型的早花pef 突变体和抑制spy3表型的晚花ros突变体。比较ga1-t ros，ga1-t和ga1-t pef突变体间开花时间及开花相关基因的表达差异，进而推测ROS和PEF在调控开花
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机制中的可能功能。
(2) ROS和PEF基因克隆，分析基因表达模式和抗体制备。分析ROS和PEF
对SPINDY或者DELLA蛋白功能的影响。
(3) 通过酵母杂交和免疫共沉淀分析可能与ROS和PEF蛋白质相互作用的蛋
白（或基因），深入探讨ROS和PEF在植物开花调控中的功能，重点分析这些新成分在控制植物开花中的功能，揭示赤霉素调控植物开花的分子机制。
2) 蛋白质复合体对开花关键基因表达调控的分子机制研究。鉴定蛋白质复合体
组分，重点阐述蛋白质复合体对开花关键基因表达调控的分子机制。具体内容包括：
(1) 通过GI-TAP和SPY-TAP转基因材料，利用生物化学和蛋白质组学分析
手段，鉴定SPINDY蛋白质复合体新组分。
(2) 分析T-DNA插入突变体表型，明确SPINDY蛋白对蛋白质复合体形成
以及蛋白质复合体形成对关键开花基因染色质修饰的影响，揭示这些新组分对关键开花基因表观遗传调控的分子机制。
(3) 通过蛋白质免疫共沉淀和酵母双杂交分析，分析PICKLE的互作蛋白及
蛋白复合体；并将pkl与hac1突变体进行比较，利用ChIP方法分析PKL结合于开花调控因子启动子区域的染色质状态，探讨PKL与HAC1、FLC和LFY在功能上的关系。
3) 蛋白质翻译后修饰调控植物开花过程的表观遗传信号网络研究。解析多种
组蛋白翻译后修饰调控植物开花的遗传和表观遗传机理，阐明自主通路感应自身发育进程的信号促进植物开花的机理。具体内容包括：
(1) 在基因组水平上，利用Solexa大规模测序技术，比较野生型Col和atprmt5
突变体基因的表达模式，重点分析mRNA可变剪切的变化及其对开花的调控机制。
(2) 构建atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b突变体之间的双、三突变体和与athac1
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等自主通路突变体之间的多突变体，研究这些基因与拟南芥开花自主通路突变体的遗传关系。
(3) 通过蛋白质免疫共沉淀和酵母双杂交分析，鉴定AtPRMT5、AtPRMT10和
AtPRMT 4a/b的互作蛋白及蛋白复合体，在体内外验证这些互作蛋白参与调控拟南芥开花的遗传网络。利用定点突变技术，鉴定参与AtPRMT10蛋白二聚体形成和自身甲基化位点，利用遗传学手段研究AtPRMT10自身翻译后修饰调控开花的机理。
(4) 利用亲和层析，寻找能够特异识别对称性和非对称性双甲基化的精氨酸残基
的蛋白，阐明这些甲基化信号是如何被读取和传导以调节拟南芥开花的。 (5) 结合蛋白双向电泳和精氨酸甲基化特异性抗体等分析手段，比较野生型Col
和atprmt5、atprmt10和atprmt4a/4b单突变体及其双、三突变体蛋白质甲基化谱式的改变，通过质谱分析出蛋白，进一步在体内、外验证该蛋白是哪种AtPRMT的特异性底物，并通过遗传学、细胞生物学和分子生物学等手段，研究这些蛋白调控拟南芥开花的分子机理。
(6) 利用反向遗传学手段，分离鉴定参与开花调控的新的表观调控因子，揭示这
些因子调控植物开花过程的信号网络。
研究目标：鉴定GA开花调控途径中新成员的2个；确定拟南芥中多个蛋白精氨酸甲基转移酶和组蛋白去甲基化酶等蛋白质翻译后修饰因子调控开花过程的靶基因3-5个；提出1-2个关键开花基因遗传和表观遗传调控分子机制的模型。发表高影响因子的SCI论文10篇、总影响因子50以上；培养研究生10名、博士后2人。 承担单位： 中国科学院遗传发育生物学研究所 课题负责人： 曹晓风
主要学术骨干： 傅向东、范六民、王涛、侯岁稳 课题1经费比例： 36％
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