第4期
沈延等: TALEN构建与斑马鱼基因组定点突变的实验方法与流程 543 (包括起始载体和中间载体)进行测序验证, 则只要测序结果正确即可, 无论所得到的序列跟预期序列等同还是反向互补, 均可用于后续的组装步骤。
(2)为了尽量降低序列的重复性, 本实验室采用的TALE重复单元中除了RVD之外, 某些其它位点(例如第四位的氨基酸残基)的序列也有可能存在一些差异(例如第四位的氨基酸残基有可能为A、D或E), 但是并不影响使用(图10)。
图10 TALE重复单元中可变的氨基酸残基
(3)本方法(“单元组装法”)在载体构建上有一个独特的优点：载体构建过程中每一轮产生的中间载体(甚至酶切、回收的产物)都可以保留下来, 用于其他TALEN的构建。这样一方面可以避免重复构建中间载体, 另一方面可以节省时间和精力, 提高构建效率。TALEN载体构建得越多, 中间载体就会积累得越多, 这样新TALEN的构建效率也会越来越高。例如, 如果预先构建好全部16个双单元载体, 就可以直接从双单元开始构建TALEN, 而不需要从单载体开始, 这样就可以节省一轮的时间; 如果除了4个单载体之外, 还预先构建好全部的双单元(16个)、三单元(64个)和四单元(256个)载体, 那么只需要两轮就可以构建出16个完整的TALE重复单元, 比从单载体开始可节省一半的时间。 3.4 TALEN组装中的酶切问题
NheⅠ、SpeⅠ和HindⅢ等内切酶也可以选用其他公司的产品。根据我们的经验, 用NheⅠ和HindⅢ双酶切TALE重复序列载体时有时会出现多余的条带(预期应该只有一个条带), 这有可能是NheⅠ或HindⅢ的星活性造成的。如果出现这种情况, 建议改用NEB的HF(high fidelity)酶, 同时减少质粒的用量(例如<1 μg), 酶切时间也不要太长(例如控制在2 h之内)。 3.5 TALEN显微注射的问题
对于新构建的TALEN对, 可尝试注射不同的剂
量的mRNA, 从中选取一个最佳剂量用于制备斑马鱼突变体。一般而言, mRNA的注射量越大, TALEN作用的效率就越高, 不过, 斑马鱼胚胎的畸形率也会随之上升、存活率下降; 每半位点TALEN mRNA的注射剂量超过100 pg后胚胎畸形率的上升会更为明显。根据我们的经验, 剂量范围可控制在50~150 pg/半位点, 一般100 pg左右为最佳剂量, 可兼顾胚胎的存活率和TALEN的效率。在这个剂量下, 斑马鱼胚胎的存活率一般可达到90%以上。
4 结果示例与经验总结
本实验室在原来已发表的文章基础上, 增加了针对最后一位碱基(对应最后的0.5个TALE重复单
元)为A、C和G的FokⅠ载体, 并构建出了所有的三单元TALE载体(64个)和四单元TALE载体(256个), 这样既扩大了靶点的选择范围, 又可以节省载体的构建时间。目前, 本实验室利用单元组装法已成功构建了100多对针对斑马鱼不同基因组位点的TALEN, 经内切酶检测, 突变成功率大于70%(未发表数据), 这与Cade等[19]最近报道的结果类似。本实验室一半以上的TALEN位点的突变效率大于30%, 有的甚至接近100%, 这充分显示了在斑马鱼中应用TALEN技术的高效和简便。其中, 本实验室大部分未检测到活性的TALEN靶点的信息可参考EENdb网站(http://eendb.zfgenetics.org/)[10]。
斑马鱼性成熟一般需要3个月的时间。如果希望加快实验进度, 可以通过增加营养、改善饲养条件来缩短斑马鱼性成熟所需的时间。例如, 鱼的密度要适中, 在正常喂食之外加几次餐, 特别是晚上要加餐。如果饲养得当, 大部分雄鱼出生后两个月即可跟雌鱼杂交产生后代。最快甚至可以做到一个半月的雄鱼就开始用于交配、产生后代。在同等的饲养条件下, 雌鱼所需的性成熟时间要相对长一些。建议优先筛选雄性F0。根据我们的经验, TALEN的效率达到10%以上时, 一般最多筛选10个F0即可获得所需的突变。
打靶成功后, 建议至少保留两个不同的(indel)突变鱼系, 并且最好是造成不同的frame-shift突变, 以便相互印证突变表型。注意根据斑马鱼突变体和等位基因的命名规则为筛选到的鱼系和突变进行正确命名[20,21]。
如果得到了很重要的突变体, 建议考虑
544 HEREDITAS (Beijing) 2013 第35卷
通过精子冻存的方法进行长期保种[22]。
附 录：补充材料见WWW.Chinagene.cn。
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