形成果糖-1,6-二磷酸。在醛缩酶催化下,果糖-1,6-二磷酸裂解成两个三碳化合物:3-磷酸甘油醛与磷酸二羟丙酮。此阶段的反应并不涉及电子转移。
(1 )葡萄糖+ATP____己糖激酶__6-磷酸葡萄糖+ADP (2)6-磷酸葡萄糖__磷酸己糖异构酶_6-磷酸果糖 (3)6-磷酸果糖 _ 磷酸果糖激酶_1,6-二磷酸果糖
(4)1,6-二磷酸果糖_醛缩酶_3-磷酸甘油醛+磷酸二羟基丙酮 (5)磷酸二羟基丙酮__磷酸甘油异构酶__3-磷酸甘油醛
在第二阶段中,3-磷酸甘油醛首先转化为1,3-二磷酸甘油醛,此过程是氧化反应,辅酶NAD+接受氢原子,形成NADH。同时3-磷酸甘油醛接受无机磷酸被磷酸化。与上述的葡萄糖-6-磷酸的有机磷酸键不同,二磷酸甘油醛中的两个磷酸键属于高能磷酸键。在其后来的1,3-二磷酸甘油酸转变成3-磷酸甘油酸及磷酸烯醇式丙酮酸转变成丙酮酸的反应过程中,高能磷酸键的能量转移导致ATP的合成。
6)3-磷酸甘油醛+NADH +H3PO4___3-磷酸脱氢酶_1,3-二磷酸甘油酸(EMP 途径中第一个氧化还原反应)
(7)1,3-二磷酸甘油酸+ADP_磷酸甘油酸激酶_ 3-磷酸甘油酸(EMP途径第一个产生ATP)
(8)3-磷酸甘油酸___变位酶__2-磷酸甘油酸
(9)2-磷酸甘油酸__烯醇化酶(脱去一分子水) 烯醇式磷酸丙酮酸 (10)烯醇式磷酸丙酮酸+ADP___丙酮酸激酶_丙酮酸+ATP
在EMP途径第一阶段有两分子的ATP用于糖的磷酸化,但最终产生出四个分子的ATP。因此,通过EMP途径,每氧化一个分子的葡萄糖净得两分子ATP。在形成1,3-二磷酸甘油醛的过程中,两分子NAD+被还原为NADH。
据酶的作用机理酶可以分6大类,试述每类酶的作用特点并举例说明
根据酶所催化的反应类型将酶分为六大类:氧化还原酶类,转移酶类,水解酶类,裂解酶类 ,异构酶类,合成酶类
1、氧化还原酶类
催化生物氧化还原反应的酶,如脱氢酶、氧化酶两类。 (1) 氧化酶类 催化底物脱氢,并氧化成H2O2或H2O A·2H+O2?A+H2O2 2A·2H?2A+2H2O
如葡糖氧化酶的每个酶分子中含有两分子FAD作为氢受体,催化葡萄糖氧化成葡糖酸,并产生H2O2
以血红素为辅基的细胞色素C氧化酶催化底物脱氢,并氧化生成水。 (2)脱氢酶类 催化直接从底物上脱氢的反应,即A·2H+B?A+B·2H
这类酶需要辅酶I和辅酶II作为氢供体或氢受体起传递氢的作用。例如乳酸脱氢酶以辅酶I为辅酶将乳酸氧化成丙酮酸。乳酸脱氢酶
3CHCOOHCHNAD+CH3CCOOHNADHH+O OH 除此还有过氧化物酶、羟化酶以及加氧酶类。
氧化还原酶类由于作用的供体不同,可分为18个亚类。 2、转移酶类
催化不同物质分子间某种基团的交换或转移的酶,即将一种分子上的某一基团转移到另一种分子上的反应:A·X+B?A+BX。如转甲基酶、转氨基酶、已糖激酶、磷酸化酶等。
如谷丙转氨酶属于转移酶类转氨基酶。该酶需要磷酸吡哆醛为辅基,使谷氨酸上的氨基转移到丙酮酸上,使之成为丙氨酸,而谷氨酸成为a-酮戊二酸 谷丙转氨酶
CH3CHCOOHNH2CH3CCOOHOHOOCCH2CH2CCOOHOHOOCCH2CH2CHCOOHNH2这一大类中还有转移碳基、醛或酮基、酰基、糖苷基、磷酸基和含硫基的酶 3、水解酶类
利用水使共价键分裂的酶,催化水解反应。可用下面通式表示 A-B+HOH?AOH+BH
水解酶类大都属于细胞外酶,在生物体内分布最广,数量也多,包括水介酯键、糖苷键、醚键、肽键、酸酐键及其他C-N键共11个亚基,常见的有淀粉酶、蛋白酶、酯酶、核糖酶和脂肪酶等
RCOOCH2CH3H2O脂肪酶
RCOOHCH3CH2OH
4、裂解酶类
由其底物移去一个基团而使共价键裂解的酶,催化从底物移去一个基团而形成双键的反应及其逆反应,用下式表示A·B?A+B
这类酶包括最常见的C-C、C-O、C-N、C-S裂解酶亚基。 如脱羧酶、醛缩酶和脱水酶等。
醛缩酶可催化果糖—1,6-二磷酸成为磷酸二羟丙酮及甘油醛—3—磷酸。L-组氨酸裂合酶催化非氧化氢、非水解性的脱氨反应,使组氨酸脱氨生成咪唑丙烯酸。 还有延胡索酸水合酶: 延胡索酸水合酶 HOOCCH=CHCOOHH2OHOOCCH2CHCOOHOH 5、异构酶类
促进异构体相互转化的酶,即分子内部基团的重新排列,简式如下 A?B
如消旋酶、顺反异构酶、差向异构酶、分子内氧化还原酶和分子内裂解酶等亚基等。
如:6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应,催化葡糖-6-磷酸转变为果糖-6磷酸。
CH2OHOOHOHOHOH6-磷酸葡萄糖异构酶CH2OHOCH2OHOHOHOH又如D-氨基酸消旋酶可使D-氨基酸变成L-氨基酸。 6、合成酶类
促进两分子化合物互相结合(C-C、C-O、C-N 以及C-S键和磷酸酯键形成),同时使ATP分子中的高能磷酸键断裂的酶,既由两种物质合成一种新物质的反应。简式如下
A+B+ATP?A·B+ADP+Pi 或A+B+ATP?A·B+AMP+PPi
如谷氨酰胺合成酶、谷胱甘肽合成酶等。 丙酮酸羧化酶
丙酮酸 + CO2 ? 草酰乙酸 还有L-酪氨酸tRNA合成酶催化L-Tyr-tRNA的合成。 CTP合成酶可催化UTP合成CTP。
试叙述蛋白质的纯化原则和常用的分离纯化方法
原则:
蛋白纯化要利用不同蛋白间内在的相似性与差异,利用各种蛋白间的相似性来除去非蛋白物质的污染,而利用各蛋白质的差异将目的蛋白从其他蛋白中纯化出来。每种蛋白间的大小、形状、电荷、疏水性、溶解度和生物学活性都会有差异,利用这些差异可将蛋白从混合物中提取出来得到纯蛋白。
蛋白质纯化的总目标是增加制品的纯度和比活,以增加单位蛋白质重量中所要蛋白质的含量或生物活性。设法出去不要的或变变性的蛋白质,斌那关切希望所得蛋白质的产量达到做大值。为了尽量达到目标,一般从以下几个方面考虑 1. 材料的选择与破碎
根据实验目的选择合适的材料,应遵循: 材料来源方便、成本低、易操作;目的蛋白含量及生物活性尽可能高;可溶性及稳定性要尽可能好 细胞的破碎先要将细胞和组织破碎,使蛋白质充分释放出来 2. 建立蛋白质的活性测定方法
一般测定的方法要特异、快速、精确、可重复、经济,常见的方法有总蛋白含量的测定、蛋白质比活性、得率等
3. 分离纯化应遵循分级分离、先粗后细的原则
蛋白的纯化大致分为粗分离阶段和精细纯化阶段二个阶段。一般蛋白纯化采用的方法为树脂法。粗分离阶段主要将目的蛋白和其他细胞成分如DNA、RNA等分开,由于此时样本体积大、成分杂,要求所用的树脂高容量、高流速、颗粒大、粒径分布宽.并可以迅速将蛋白与污染物分开,必要时可加入相应的保护剂,防止目的蛋白被降解。精细纯化阶段则需要更高的分辨率,此阶段是要把目的蛋白与那些分子量大小及理化性质接近的蛋白区分开来,要用更小的树脂颗粒以提高分辨率,常用离子交换柱和疏水柱,应用时要综合考虑树脂的选择性和柱效两个因素。
4. 分离纯化条件
为了避免目的蛋白的变性,保证其生物活性,在纯化过程中适当的使用缓冲液盐、金属离子和螯合剂、还原剂、去垢剂 、蛋白酶抑制剂,控制好蛋白质的环境因素。 分离纯化方法
(1) 根据分子大小不同的分离方法:
透析和超过滤:利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质, 使蛋白质和其它小分子物质如无机盐、单糖、水等分开 ;
密度梯度离心:蛋白质在介质中离心时质量和密度较大的颗粒沉降较快;
凝胶过滤:一种柱层析, 又称分子筛层析和分子排阻层析,这是根据分子大小分离蛋白质混合物的最有效方法之一 (2) 利用溶解度差别分离:
等电点沉淀法:当蛋白质处于等电点pH时,蛋白质的净电荷为零, 由于蛋白质分子在等电点时净电荷为零,减少了分子间静电斥力,因而容易聚集沉淀,此时溶解度最小;
盐溶与盐析:利用一定浓度盐溶液增大或减小蛋白质的溶解度。最经典的方法,常用来进行粗分离,常用中性盐,主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠等,其中应用最广的是硫酸铵,影响盐析的因素很多,如pH、温度、蛋白质浓度等都会影响各种蛋白质的盐析点
低温有机溶剂沉淀法: 用与水可混溶的有机溶剂,甲醇,乙醇或丙酮,能降低溶液的介电常数,从而增加蛋白质分子之间不同电荷的引力,导致溶解度的降低并析出;另外有机溶剂与水的作用,能破坏蛋白质的水化膜,使蛋白质在一定浓度的有机溶剂中沉淀析出 ,此法分辨力比盐析高,但蛋白质较易变性,应在低温下进行
(3)根据电荷不同的分离方法,主要包括电泳和离子交换层析分离;
电泳是在外电场作用力存在下,利用电子携带的净电荷不同以分离混合物的一种实验技术 又包括:
a.区带电泳:如醋酸纤维薄膜电泳,PAGE等,PAGE较经常使用:聚丙烯酰胺凝胶电泳 用于分离蛋白质和寡糖核苷酸。聚丙烯酰胺凝胶为网状结构,具有分子筛效应。它有两种形式:非变性聚丙烯酰胺凝胶及SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE);非变性聚丙烯酰胺凝胶,在电泳的过程中,蛋白质能够保持完整状态,并依据蛋白质的分子量大小、蛋白质的形状及其所附带的电荷量而逐渐呈梯度分开。
b.等电聚焦:具有更高分辨率的电泳技术,是一种自由界面电泳,这种分离技术在具有PH梯度的介质中进行的
c.层析聚焦:根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。
d.毛细管电泳:在细孔管或毛细管中进行电泳分离。柱效高、分析时间短,所用样品量及试剂消耗少,操作模式多,可以进行在线检测和自动化
离子交换层析:固定相是离子交换剂的层析分离技术。样品中待分离的溶质离子,与固定相上所结合的离子交换,不同的溶质离子与离子交换剂上离子化的基团的亲和力和结合条件不同,洗脱液流过时,样品中的离子按结合力的弱强先后洗脱,从而达到分离纯化的目的。
(4)蛋白质的选择吸附分离:利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解析性质不同而达到分离目的。有羟磷灰石层析和疏水作用层析
羟磷灰石层析:用于分离蛋白质和核酸
疏水作用层析:根据蛋白质表面的疏水性差别发展起来的一种纯化技术。 (5)根据配体特性的分离
亲和层析:利用蛋白质分子与另一种称为配体的分子能够特异而非共价地结合这一生物性质建立起来的一种有效分离方法,亲和层析法可在温和条件下操作,纯化过程简单、快速、分辨率高,对分离含量少且性质不稳定的生物活性物质极为有效
(6) 高效液相层析和快速蛋白质液相层析
高效液相层析:具有快速、高分辨率和高灵敏度的液相层析技术。在技术上配置了高压泵、耐高压并有高效交换性能的固定相、高灵敏度检测器等。通常主要是围绕用高压使洗脱液通过层析柱而达到高效
快速蛋白质液相层析:以高流率代替高效液相层析高压力的一种改良的中压(< 5 MPa)液相层析技术。具有快速、容量大和分辨率高的特点。可使用多种层析介质,多用于蛋白质的分离,也可以用于其他物质的分离。
简述淀粉的结构特点,试叙述其主要的衍生物
淀粉粒由二种葡聚糖组成,即直链淀粉和支链淀粉。多数淀粉含20~25%的直链淀粉;少数淀粉粒含75—80%支链淀粉。 (1)直链淀粉分子结构
直链淀粉在水溶液中并不是线型分子,而是由分子内的氢键作用使之卷曲成螺旋状,而且是左手螺旋,每个螺旋含有6个葡萄糖残基,螺距0.8nm,直径1.4nm。淀粉的螺旋结构并不十分稳定,当不与其他分子如碘作用时,直链淀粉很可能是以无规卷曲形式存在。
直链淀粉是由葡萄糖以α一1,4糖苷键缩合而成的,聚合度为100~6000之间,一般为几百。分子量为3万2~16万。直链淀粉有方向性,一端是还原端,一端是非还原端。 (2)支链淀粉分子结构
支链淀粉是“树枝”状结构,A、B和C三种链,C链是主链,每个支链淀粉分子只有一条C链,一端为非还原端基,另一端为还原端基; A链是外链,经由α-1,6键与B链连接,B链又经由α-1,6键与C链连接,A链和B链平均含