紫花苜蓿抗旱的研究进展
赵颖
（甘肃农业大学 甘肃兰州 730070）
摘要：干旱是影响植物生长发育及作物产量的逆境因素之一,影响了植物的正常生长发育，导致植被减少和草地退化等现象。有关苜蓿的抗旱性研究一直以来都是牧草学研究的热点之一,研究领域也逐渐从形态水平发展到生理、生化及分子生物学等更深入的领域,并取得了很多有价值的研究成果。现对苜蓿在干旱胁迫下各项生理指标、分子水平及品种选育的研究进行综述,并对研究中存在的问题及今后的应用前景进行了简单的讨论。
1 形态指标与抗旱性
1.1 叶片结构与抗旱机制
水对于植物来说是必不可少，植物一旦缺水就会发生枯萎甚至死亡。当干旱发生时，植物的组织器官、个体形状、大小以及群体的组成形态都会产生相应的反应［4］。抗旱性与植物叶片表皮外壁的角质层、栅栏组织、海绵组织等有密切关系。一些植物的叶细胞小，细胞壁较厚，厚壁的机械组织发达，上表皮细胞大于下表皮细胞，叶片气孔多而小，气孔均位于下表皮且居于表皮细胞水平下面，叶脉较密，输导组织发达，叶片表面绒毛多，角质化程度高或蜡质层厚，叶脉中的含晶细胞，这些叶片形态有利于增强植物对水分的吸收和运输并且减少了水分的蒸发和丢失，因此有较强的抗旱性［5］ 胡营等对不同水分处理的四个花苜蓿居群叶片解剖结构进行研究表明：不同水分处理对栅栏组织厚度具有明显的影响。相比湿润条件处理,在干旱条件下栅栏组织厚度都有明显增加, 细胞排列紧密程度也有所变化, 干旱条件下, 花苜蓿第一层栅栏组织细胞密集度较湿润条件下明显增大。随着水分的减少,海绵组织厚度也会减少,但陕西省兴隆山居群花苜蓿却呈现相反态势,在干旱处理下,海绵组织相对较厚。[1]
王赫等研究发现，随着干旱处理时间的继续,苜蓿幼苗出现不同程度的萎蔫,以野生黄花苜蓿和GongnongⅠ紫花苜蓿最严重,出现了小叶合拢卷曲,顶端叶片枯黄脱落等现象。幼苗株高、根长、分枝、根颈直径、叶面积都不同程度的呈减小趋势。[6] 逆境条件下植物叶片相对含水量可反映植物的保水能力,是标志植物水分状况的重要指标。南丽丽[7]等研究发现，各根系类型苜蓿叶片相对含水量随干旱胁迫程度的增加呈降低趋势。张攀[8]等研究表明，干旱胁迫下根瘤菌共生紫花苜蓿叶片相对含水量在干旱前期显著高于不接种根瘤菌紫花苜蓿。
1.2 根系与抗旱机制
根系相对含水率是反映植物根系水分状况的重要指标之一．RWC能真实反映土壤缺水时植物根系水分的亏缺程度［８］。许多研究表明,干旱胁迫抑制植物株高和根长的伸长,降低干物质的积累,改变干物质分配比例[14～ 18]。根颈是产生枝条的重要部位,直接影响苜蓿生产性能及其抗逆性,胁迫下根颈直径显著的变小。植物器官中叶片对干旱胁迫最敏感,叶面积的减小对植物来说是十分不利的[20],因为营养物质的吸收、蒸腾作用和碳同化作用都与叶面积呈显著的正相关[21]。叶绿素是绿色植物进行光合作用的主要色素,其含量的多少与牧草的光合作用及其强度有密切的关系。苜蓿叶绿素含量都随干旱胁迫的加重而降低。
2紫花苜蓿抗旱的生理生化特性研究进展 2.1 光合作用与抗旱性
光合作用是植物干物质产生积累的重要方式，与植物的生长密切相关。干旱胁迫容易导致光能过剩从而危害植物体内光合器官。光保护的主要途径是通过叶黄素循环的热耗散，并且酶促及非酶促系统也是保护光合器官免受破坏的重要过程［1］王赫等研究发现，干旱胁迫下植物光合作用受到极大
的影响,表现为净光合、蒸腾速率下降,气孔导度减小,水分有效利用率降低等现象。随着干旱胁迫强度的增加,各项指标急剧下降,光合同化作用受影响较大。[6] 干旱胁迫引起光合作用降低,是由于气孔关闭阻碍了CO2的交换和对CO2同化的非气孔性机制[26]。有研究指出,抗旱性好的苜蓿叶片的下表皮上具有较多的气孔,有较强的气体交换能力[27],蒸腾失水量较低[28,29]。王赫等对4种苜蓿幼苗研究发现，Daviluya、和Culuskaya在干旱胁迫时,能保持相对较大的气孔导度,维持一定强度的蒸腾作用,使植物能在自身水势较低的情况下吸收水分,水分有效利用率较高,更好地维持植物正常的新陈代谢。[6] 相对较高的叶片相对含水量可以有效地保持叶绿体的结构和PSⅡ功能,使植物进行有效的光合作用。能维持较高相对含水量的植物,其抗旱能力亦较强。
2.2 干旱对苜蓿种子萌发的影响
聚乙二醇 PEG-6000 因本身不易自由通过植物细胞壁，不易渗入活细胞内，不会给种子内增加营养物质，且无毒，但能减缓萌发初期水分进出种子的速率等优点，常被作为干旱胁迫的渗透胁迫剂。荣秀连等［3］研究认为，不同 PEG-6000 胁迫处理下 3 种冷季型草坪草种子的发芽率、发芽势以及胚根的生长受到抑制，抑制程度随浓度的增加越发明显。伏兵哲等[2]研究发现，苜蓿种子的相对发芽率和相对发芽势较对照有明显的下降，并随胁迫水势的加剧，相对发芽率和相对发芽势呈下降趋势，没有发现低浓度 PEG-6000 对苜蓿种子萌发有促进作用。 2.3 渗透调节物质与苜蓿的抗旱性
2.3.1 脯氨酸含量与苜蓿抗旱性
Pro是植物体内重要的渗透调节物质之一．当植物受到逆境胁迫时，尤其是干旱时造成体内脯氨酶积累最多．一般而言，抗旱性强的植物Pro积累时间长，积累量也较大。朱新强[10]等对4个苜蓿品种幼苗进行研究发现，干旱胁迫均促进了4个苜蓿品种根系Pro的增加，不同程度干旱胁迫处理下，4个苜蓿品种根系Pro含量差异显著。王赫等研究发现，叶片游离脯氨酸含量均随干旱胁迫强度的加剧而增加，幼苗在干旱胁迫下电解质外渗率升高。[6] 电解质外渗率反映胁迫下膜系统受损情况,抗旱性强的苜蓿品种干旱胁迫后细胞外渗液的电导率较低[11] 渗透调节是植物对干旱逆境的一种重要生理适应机制,作为主要渗透调节物的脯氨酸在干旱条件下大量积累有助于植物细胞或组织的持水,增强其抗旱性。有研究表明：干旱胁迫下各根型苜蓿叶片脯氨酸含量均显著高于对照。重度胁迫下，各根系类型苜蓿脯氨酸积累量达到最大[7]。
2.3.2 MDA含量与苜蓿抗旱性
植物器官在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，ＭＤＡ是膜脂过氧化的最终分解产物，可以衡量逆境下膜脂过氧化水平，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即膜脂过氧化程度随品种抗旱性下降而加剧。随着干旱胁迫程度的加剧，４个苜蓿品种根系 ＭＤＡ 含量都逐渐增多，但MDA的积累程度在不同品种间表现不同[10]。有研究发现，不接种根瘤菌紫花苜蓿根、莲、叶中含置明显髙于根瘤菌共生紫花苜蓿，各胁迫时间点均差异显著[8]。
2.3.3 干旱胁迫下紫花苜蓿中游离态多胺含量的变化
植物感受干旱胁迫时，多胺水平升高，ＰＡｓ含量的积累与植物抗旱性关系密切［２－６］刘义[30]等研究表明，干旱胁迫下，紫花苜蓿幼苗叶片中３种游离态多胺（Put、Spd、Spm）的含量均大幅度增加，随着胁迫时间的延长先上升后下降，且胁迫程度越大，多胺的增加幅度越大。PA 可通过稳定质膜和提高细胞内保护酶（超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶、抗坏血酸过氧化物酶）活性以及提高ABA含量或改变不同激素成分的含量来增强对渗透胁迫的抵抗能力。逆境胁迫下，活性氧的产生与清除体系与多胺存在着重要的关联。干旱胁迫下，紫花苜蓿体内多胺代谢的变化是对干旱逆境的一种抵御和适应机制。
2.3.4 可溶性糖与苜蓿抗旱性
TSS是植物体内另一种重要的渗透调节物质，被认为是对干旱忍耐的适应物质，主要有蔗糖、葡萄糖、果糖、半乳糖等．TSS是一种较为有效的渗透保护剂，它可有效地提高细胞的渗透浓度,降低水势,增加保水能力,对原生质体起到保护作用。在干旱逆境胁迫下，随胁迫程度的加剧，TSS含量增加．朱新强等研究发现，不同苜蓿品种根系TSS含量随干旱胁迫程度的加剧而升高，不同程度干旱胁迫下，各苜蓿品种根系TSS含量差异显著。
2.3.5 脱落酸与苜蓿抗旱性
2.4 其他酶类与抗旱机制
PAO是催化生物体内ＰＡｓ降解的关键酶之一，Put和Spd的过度积累将作为一种很好的底物激发PAO活性，PAO通过调节细胞内PAs的水平和生成物浓度参与植物体对逆境胁迫的反应和生长发育过程。 干旱胁迫下，紫花苜蓿中PAO活性与Spd、Spm含量变化趋势相似且呈极显著相关，可能是Spd、Spm二者含量的增加反馈致其氧化酶PAO活性增高，进而维持多胺代谢平衡［19］刘义[30]等研究认为， 精氨酸脱羧酶（ADC）和鸟氨酸脱羧酶（ODC）为多胺生物合成的关键酶。干旱胁迫下紫花苜蓿叶片和根系中 ADC、ODC活性变化趋势相似。随胁迫程度增大，二者活性均增大，随着胁迫时间的延长，二者活性先增大后减小。植物体内多胺氧化酶（PAO）催化亚精胺和精胺分解产生的 H2O2，会对植物细胞造成一定的伤害。干旱胁迫下，紫花苜蓿叶片和根系中PAO活性上升，处理期间PAO活性上升幅度随胁迫程度加重而增大，随胁迫时间的延长，各处理PAO活性呈先增大后减小的趋势，这与Spd、Spm 含量变化相似。 SOD是细胞膜系统的重要保护酶之一，它具有消除自由基、降低膜脂过氧化及维持细胞膜稳定性的功能。朱新强等研究表明，，各苜蓿品种根系SOD活性随干旱胁迫程度的加剧呈上升趋势，不同品种苜蓿根系 SOD 活性在不同程度干旱胁迫下差异显著。张攀[8]等研究表明，根瘤菌共生紫花苜蓿根、茎、叶中可溶性糖含量、含量、含量及和活性在干旱后期明显高于不接种根瘤菌紫花苜蓿。根瘤菌共生紫花苜蓿具有更强的渗透调节能力和活性氧防御能力。
2 紫花苜蓿抗旱分子机制研究进展 2.1 紫花苜蓿抗旱基因工程研究
水资源不足是影响紫花苜蓿分布及产量的重要因素之一改良苜蓿抗旱性的基因工程研究也越来越受到重视。Rubio等[42]将Mn-SOD和Fe-SOD同时转入紫花苜蓿，发现在水分胁迫后，转基因植物的光合活性平均提高了20%。Zhang等[43]将从截形苜蓿中克隆的转录因子AP2的Cdna(WXP1)转入紫花苜蓿，转基因苜蓿叶片表皮腊层厚度增加，有效的减少了水分损失，提高了植株抗旱性。Jiang等[44]采用CER6启动子在紫花苜蓿中超表达WXP1基因，结果同Zhang等[43]的研究一致，转基因植株抗
旱能力提高。刘媛等[45]研究发现，转BADH基因的紫花苜蓿对聚乙二醇造成的渗透胁迫具有较强的抗性。Tang等[46]研究发现，超标达野生大豆锌指蛋白基因GsZFP1的紫花苜蓿耐盐、抗旱能力明显提高，其逆境响应基因MtCOR47,MtRAB18,MtP5CS和MtRD2的表达量高于野生型苜蓿。Suarez等[47]将酵母海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase,TPS）基因TPS1和海藻糖-6-磷酸酶
（trehalose-6-phosphate phosphatase,TPP）基因TPS2融合，转入紫花苜蓿，发现转基因植物具有较好的抗旱、抗寒能力，这是首次将海藻糖代谢基因应用于紫花苜蓿基因工程中。Bao[48]等将拟南芥的液泡焦磷酸化酶基因（H+-PPase）AVP1转入紫花苜蓿中，研究发现与野生型相比，转基因苜蓿在胁迫下的光合能力增高，对干旱的抗性明显增加。总之紫花苜蓿抗旱性相关基因的发现和转化研究丰富了紫花苜蓿抗旱基因工程，为改良苜蓿抗旱性奠定了研究基础。 2.2 苜蓿中发现的与干旱胁迫有关基因
湛虎[50]用mRNA差异显示技术分析干旱胁迫下苜蓿基因表达与正常供给水分的苜蓿基因表达的差异片断。通过RNA的提取和mRNA差异显示技术筛选-共得到苜蓿的差异表达片断32条。通过DDRT-PCR技术和Reverse Northern技术结合,筛选得到3条苜蓿受干旱胁迫后差异表达的基因片断。其中,1个与基因库中拟南芥水通道蛋白(Water channel)控制基因同源性达到99%,为干旱诱导表达的重要基因。另外2个基因片断与其它基因的同源性都比较低,可能为干旱诱导表达的新基因。罗琰[53]从紫花苜蓿中分离得到1个RNA解旋酶基因,命名为MH1。研究结果表明,MH1基因在植物耐受非生物胁迫的过程中起重要作用,它通过提高某些逆境响应基因的表达提高植物的活性氧清除能力和渗透调节能力,从而使得表达MH1的转基因拟南芥不同株系耐旱、耐盐和抗氧化胁迫能力都有显著提高,说明紫花苜蓿中受胁迫诱导表达的解旋酶基因MH1参与了植物的耐旱、耐盐和抗氧化胁迫过程。2009年又将该基因转入到拟南芥中,
再次确信了该基因表达能够提高植物抗旱,抗盐害的能力,因为它对ROS起反应。Tapia G等[55]通过系统发育分析发现,苜蓿的第3类内切几丁质酶中有1个命名为Ltchi7的基因簇,它编码1个334氨基酸构成的肽段,在干旱胁迫下,该基因转录的丰度增强。王天佐[54]等通过GO分类和KEGG分析等手段对文库中序列进行分类，并分析表达序列的差异，发现黄花苜蓿文库中对抵抗水分胁迫起积极作用的基因表达序列明显多于蒺藜苜蓿。此外，还对筛选到的２个基因在２种苜蓿中的干旱响应表达模式进行了分析，结果表明，在黄花苜蓿中这２个基因的表达更加有利于响应和抵抗干旱。 2.3 耐旱相关分子标记技术
通过分子标记的方法标记某种抗性基因,是近年来育种的新技术。康俊梅等[56]采用RAPD技术共筛选得到48个引物对不同抗旱性苜蓿品种池DNA扩增结果产生多态性,其中5个引物能够稳定标记DNA多态性,且特异性明显,表明不同抗旱性苜蓿品种之间具有明显的遗传多样性。Sledge M K等[57]通过SSR标记(主要是将来源于表达序列标签(ESTs)和细菌人工染色体(BAC)的插入蒺藜苜蓿)构建1个四倍体苜蓿的分子标记图谱,该图谱可用于苜蓿耐旱QTL的鉴定。 3 紫花苜蓿生产与抗旱品种的选育研究进展
尽管不同研究者对抗旱性研究从多方面做了大量的研究工作,并进行了有益的探讨,但是由于作物抗旱性不仅与作物的种类、品种基因型、形态性状及生理生化反应等有关,而且受干旱发生的时期、强度及持续时间的影响,所以作物抗旱性是复杂的数量性状[24]。山仑认为,不同作物和品种适应干旱的方式是多种多样的,一些作物和品种具有综合的几种机制共同起作用的抗旱性[25]。
我国对苜蓿抗旱育种的研究几乎是空白。目前主要从生理生态指标加以分析,中国科学院兰州沙漠研究所陶玲对甘肃省紫花苜蓿进行抗旱等级分类,对21个抗旱性指标实验测定,根据这些指标应用系统聚类的方法进行分级聚类,使其归属5个抗旱等级〔5〕。甘肃农业大学草原系马宗仁、陈宝书对甘肃境内不同地理分布的9个苜蓿品种抗旱性进行研究,结果表明苜蓿的抗旱性与其地理分布密切相关,由此可见不同地理分布的苜蓿之间具有遗传差异性〔6〕。中国农科院生物技术研究所夏兰芹等人对分子标记技术在苜蓿育种中应用作了分析总结。他们总结了2种主要的分子标记技术在苜蓿育种中的3个方面的应用,即分子标记辅助育种和种质渐渗研究、遗传连锁图谱绘制、种质鉴定和遗传多样性〔7〕。这些技术的不断发展和完善对今后苜蓿的抗旱育种提供有效的途径。
参考文献：