很难避免固定液流失，现在已很少采用。现在多采用的是化学键合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法(NPC)和反相色谱法(RPC)。
正相色谱法：采用极性固定相(如聚乙二醇、氨基与腈基键合相)；流动相为相对非极性的疏水性溶剂(烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。
反相色谱法:一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。
随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5~7.5（2~8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有报告新商品柱可在pH 1.5~10范围操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表
正相色谱法 反相色谱法
固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高
组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出
从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。
3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树脂）。被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子
交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。
缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。pH值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。
分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。 分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。 离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。
5．排阻色谱法 固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸等。
高效液相色谱仪标准操作规程
1 目的 建立高效液相色谱仪（Waterse2695-2998 Alliance）标准操作规程，为了使操作者操作高效液相色谱仪（Waterse2695-2998 Alliance）更规范，保证结果更精确。
2 范围 适用于高效液相色谱仪（Waterse2695-2998 Alliance）标准操作规程。 3 职责 操作者。 4 程序 4．1 开机
4．1．1打开Alliance电源开关，仪器进入自检状态。
4．1．2 打开检测器，“STATUS”闪烁，4分钟后“LAMP”亮，仪器正常。 4．1．3 点击menu/Status，进入“STATUS”界面，按direct function，选择dry prime后，选择“A/B/C/D”四个泵，点击“Enter”，管道快速充满液体。
4．1．4 打开电脑，点击“Empower”登陆，输入帐户“system”，密码“manager”，进入“Empower Pro”。
4．1．5 在配臵系统中新建一项目。
4．1．6 点击“运行样品”，选择“项目”，3分钟后仪器进入运行界面。 4．2 样品检测
4．2．1 点击“编辑”，编辑仪器方法并保存方法名。
4．2．2 点击“新建方法组”，编辑方法组名。（要求方法组与仪器方法同名） 4．2．3 标识样品名、进样品/进标准品、样品位臵、进样体积、运行时间后，于“file”中保存参数。
4．2．4 点击“准备”，仪器显示“准备进样”后，点击进样。 4．2．5 点击鼠标右键，选择“波长”和“正好运行时间”，保存参数。 4．3 数据处理
4．3．1 点击“浏览项目”，于“进样”栏中双击所选的样品名，进入“通道”栏，双击所选的样品名，进入样品数据主窗口。
4．3．2 选择波长，点击“提取色谱”后，积分或以处理方法向导处理数据，保存处理方法后，于“file”“保存”中保存“全部”。 4．4 打印报告
4．4．1于所选“浏览项目”结果栏中，选择已处理好的数据（如果没有，点击更新），点击右键，选择预览报告。
4．4．2 选择报告方法，确定后，进入报告预览状态。 4．5 关机
4．5．1 关闭检测器。
4．5．2 停泵后，移动光标于Alliance“degasser”中，点击Enter，选择“ off”。 4．5．3 关闭“ Power”。
4．5．4 关闭运行窗口及数据处理窗口，最后关闭 Empower窗口，关闭电脑。
HPLC操作注意事项
1.流动相必须用HPLC级的试剂，使用前过滤除去其中的颗粒性杂质和其他物质(使用0.45um或更细的膜过滤)。
2.流动相过滤后要用超声波脱气，脱气后应该恢复到室温后使用。 3.不能用纯乙腈作为流动相，这样会使单向阀粘住而导致泵不进液。
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用去离子水冲洗管路及柱子一小时，然 后用甲醇(或甲醇水溶液)冲洗40分钟以上，以充分洗去离子。对于柱塞杆外部，做完样品后也必须用去离子水冲洗20ml以上。
5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水易长霉。 6.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器。
7.堵塞导致压力太大，按预柱→混合器中的过滤器→管路过滤器→单向阀检查 并清洗。清洗方法；①以异丙醇作溶剂冲洗：②放在异丙醇中间用超声波清 洗；⑧用10％稀硝酸清洗。
8.气泡会致使压力不稳，重现性差，所以在使用过程中要尽量避免产生气泡。 9.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。 10.更换流动相时应该先将吸滤头部分放入烧杯中边振动边靖洗，然后插入新的流动相中。更换无互溶性的流动相时要用异丙醇过渡一下。
实验六 气相色谱法测定植物油脂肪酸含量
一、实验目的
1、了解气相色谱的组成与分离原理； 2、了解气相色谱仪的基本操作； 3、掌握气相色谱法定性、定量方法。
二、实验原理
气相色谱法是利用色谱柱中装入担体及固定液，用载气把欲分析的混合物带入色谱柱，在一定的温度与压力条件下，各气体组分在载气和 固定液薄膜的气液两相相中的分配系数不同，随着载气的向前流动，样品各组分在气，液两相中反复进行分配，使脂肪酸各组分的移动速度有快有慢，从而可将各组分分离开,然后进行分别测定。
氢火焰离子检测器分析原理，又称火焰离子化检测器,气相色谱法常用的检测器，是利用有机化合物在氢火焰中化学电离进行检测的检测器。当被测试样组分的分子进入氢火焰时,由于燃烧生成离子,并在电场中作定向移动而形成离子电流,经电子放大后在仪表上显示。
三、仪器与材料 1、仪器
气相色谱仪
氢火焰离子化检测器 氮气、氢气、空气 毛细管色谱柱DB-23。 2、试剂
(1)石油醚(沸程30～60℃)分析纯 (2)苯
(3)无水甲醇（分析纯、色谱纯）
(4)甲醇钠：0.5mol/L甲醇钠溶液：以无水甲醇（分析纯）配制。