切换成自动控制，具体步骤为：
2、 3、
(1)关闭机箱面板上的“冷却”开关；
(2)将机箱面板上的“手动/自动”开关处于开启状态，此时，控制器处于自动控制状态；温度达到培养工艺所需的设定值时，消毒灭菌全过程完毕；
4、
(3)按工艺要求，设置工艺所需各个参数，待接种。
注意：冷却过程中空气流量不要过大，搅拌速度可适当降低，并严格控制罐压，以防泡沫携带量过多。
实验七 脂肪酶的发酵生产
一、实验目的与要求 1. 了解微生物脂肪酶；
2. 熟悉影响细菌产脂肪酶的发酵条件； 2. 掌握发酵实验的基本操作；
二、实验原理 1. 脂肪酶
脂肪酶即三酰基甘油酰基水解酶，它催化天然底物油脂水解，生成脂肪酸、甘油和甘油单酯或二酯。反应式为：
RCOOH+NaOH ——RCOONa+H2O
脂肪酶在微生物中有广泛的分布，其产生菌主要是霉菌和细菌。
脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。不同来源的脂肪酶具有不同的催化特点和催化活力。其中用于有机相合成的具有转酯化或酯化功能的脂肪酶的规模化生产对于酶催化合成精细化学品和手性化合物有重要意义。 2. 影响产脂肪酶的条件
影响微生物脂肪酶发酵的因素主要有：1) 碳源，2) 氮源，3) 金属离子，4) 诱导剂，5) 非离子表面活性剂等。微生物脂肪酶发酵的碳源通常为碳水化合物如葡萄糖、可溶性淀粉、糊精、糖蜜、麦麸、小麦粉等，某些微生物还可以利用油脂或脂肪酸作为碳源。有机氮源和无机氮源都有利于酶的形成，而一般来说复合氮源对微生物发酵和产酶比单一无机氮和有机氮更有效，氮源一般为黄豆粉、蛋白胨等。对于霉菌来说，脂肪酶发酵所需氮源较其它
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菌种要更高。微量元素对微生物发酵产生脂肪酶有着显著影响。一般认为，脂类物质的添加可明显增加微生物脂肪酶的产量，不饱和脂肪酸对脂肪酶的形成有明显的促进作用，而饱和脂肪酸作用则不明显。
除了上述因素外，影响微生物脂肪酶发酵的因素还包括温度、pH、转速、培养时间等。 三、实验用品
1. 试剂：橄榄油，蛋白胨，酵母膏，NaCl，乳化剂OP
2. 仪器：超净工作台，摇床，灭菌锅，三角瓶(250mL)，纱布，棉线，牛皮纸，称量天平，烧杯，玻璃棒，药勺，称量纸，量筒，移液器。
四、实验步骤 1. 培养基的配制
培养基配方：酵母膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 3 g/L，橄榄油100 mL/L，聚氧乙烯辛基苯基醚（乳化剂OP）50 mL/L。
按照培养基配方分别称量固体药品至烧杯中，加水进行溶解，分装至三角瓶(250mL)中，每瓶装液量为50mL。再将将橄榄油、聚氧乙烯辛基苯基醚按比例分别加入三角瓶中，用纱布将瓶口塞紧，牛皮纸包住后用棉线扎紧，121℃下灭菌15～20分钟后，放入无菌操作台中备用。 2. 接种
从液体种子培养基中用1000ul移液器吸取种子培养液至灭菌后的发酵培养基中，接种量为2%VVM。 3. 发酵
将接种后的三角瓶放入摇床中，30℃，180r/min，摇瓶发酵72h。
思考题
1. 产脂肪酶的微生物主要有哪些？ 2. 影响脂肪酶发酵的条件有哪些？ 3. 接种时应注意哪些问题？ 实验八 脂肪酶酶活力的检测
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一、实验目的与要求
1. 了解脂肪酶酶活力测定的方法； 2. 熟悉脂肪酶经典检测法的原理； 2. 掌握利用滴定法测定脂肪酶的方法；
二、实验原理
1. 脂肪酶的主要检测方法
脂肪酶的催化作用系统是一种非均相体系，水溶性的酶催化作用发生在水不溶性底物和水的界面上。脂肪酶的测定方法可分三类：(1)通过测定底物的减少来度量酶活的大小；(2)测定产物增加判断酶活的大小；(3)其他方法。 (1) 测定底物的减少量
主要分为浊度测定法、Wilhelmy平板法、原子显微镜和红外线光谱法四种。 (2) 测定酶解产物的增加量
测定酶解产物的增加量即根据底物进行脂肪酶活力的测定主要有两大类：一类是天然油脂，最常用的是橄榄油；另一类是人工合成的特殊底物。天然油脂法主要包括：滴定法即脂肪酶测定经典法、测pH 值法、测脂肪酸比色法。 (3) 其它方法
包括免疫学方法、荧光测定法、油滴法和电子传导法 2. 脂肪酶经典检测法的原理
脂肪酶作用于橄榄油，催化其酯键水解，生成脂肪酸，用酚酞为指示剂，用标准NaOH溶液滴定脂肪酸，根据NaOH的用量来计算脂肪酶活力。以每分钟分解底物(橄榄油)释放出1 mol游离脂肪酸所需酶量定义为一个脂肪酶活力单位， 国际单位( IU)，以1 U/mL 表示。
三、实验用品
1. 试剂：橄榄油，聚乙烯醇，95%乙醇，甘氨酸，氢氧化钠，酚酞；
2. 高速匀浆机，烘箱，分析天平，恒温水浴锅，pH计，碱式滴定管，三角瓶(250mL)，铁架台； 四、实验步骤 1. 反应底物的制备
将橄榄油与3 %的聚乙烯醇溶液按1∶3 (V ∶V )混合，在组织搅拌机中高速匀浆，混合为
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乳白色的乳化液并作为反应底物待用。 2. 甘氨酸- NaOH缓冲液的配制（见表1） 3. 脂肪酶酶活力的测定
(1) 将乳化液与pH 8.0 的甘氨酸- NaOH 缓冲液以4∶5 (V ∶V )混合，将pH调至8.0， 制成反应液。
(2) 移取9 mL反应液加入到250 mL三角瓶中，再加入1mL离心后的发酵上清液（以加入1mL蒸馏水作为对照组），置于35 ℃的水浴锅中反应10 min 后，加入95 %乙醇终止反应；以酚酞为指示剂用0.05 mol·L - 1的NaOH 溶液滴定反应液至中性， 重复测定3次并记录数据。 (3) 酶活力计算方法如下：
脂肪酶活力(U) = (V - V 0) ×50 ×n /t
式中：V 为样品所耗碱的体积(mL)；
V 0 为空白耗碱的体积(mL)； t 为反应时间(min)； n 为稀释倍数；
50 为1 mL 0.05 mol·L - 1氢氧化钠的微摩尔数。
五、注意事项
1．采用橄榄油乳化液为底物，显乳白色会干扰酚酞的变色，影响终点的判别； 2. 反应体系含有缓冲液,产生的脂肪酸为弱酸，会影响中和滴定；
六．实验结果与讨论
编号 1 2 2
V
V 0
发酵上清液脂肪酶活力= (V - V 0) ×50 ×n /t
思考题
1. 滴定法测定脂肪酶活力的原理是什么？ 2. 测定中甘氨酸- NaOH的作用是什么？
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3. 在用滴定法测定脂肪酶活力时影响测定准确率的因素有哪些？
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