本科学生综合性实验报告
学号 姓名
学院 生命科学学院 专业、班级 09级生物科学B班 实验课程名称 植物组织培养实验 教师及职称 龙维彪（讲师） 开课学期 2011 至 2012 学年 下 学期
填报时间 2012 年 6 月 1 日
一．实验设计方案实验序号 实验时间 二 实验名称 胡萝卜愈伤组织的诱导培养 实验室 327 2012.2——2012.6 1.实验内容： 1、 胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制 2、 胡萝卜愈伤组织的诱导 3 、胡萝卜愈伤组织继代培养基的配制 4 、胡萝卜愈伤组织的继代培养 2．实验目的 1) 通过本次实验，能熟练准确配制MS培养基母液和组培室常用的化学试剂。 2) 通过本次实验，使学生能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合的培养基配方。 3) 通过本实验，使同学们能够熟练的掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，同时能设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基。 4) 通过本次实验，使同学们熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基。 3． 实验原理、实验流程或装置示意图 1）、培养基的成分 目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成。 2)、培养基的配制方法 Ⅰ、配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸馏水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸馏水使之达到最终的容积。最后调节PH值，高压灭菌，于是制成所需要的培养基。 Ⅱ、如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制： ①一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起。 ②另一个是先配制一系列的浓缩贮备液（母液），贮存在2~4℃冰箱内，待配培养基时取出，按比例稀释配用。此法较为常用。 3）、MS培养基母液的配制 在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或微量）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序，以免发生沉淀。 通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42-和PO43-错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物；同时，要慢慢地混合，边混合边搅拌。 母液的配制有两种方法： ⅰ一种是配制成单一化合物母液。此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液。 ⅱ另一种是配成几种不同化合物的混合母液。此法在大量配制同种培养基时省力。 配好的母液应放在试剂瓶中贮存。 4．实验方法步骤及注意事项 实验步骤： (1)胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配方及配制体积 A、培养基配方设计： a根据培养的目的选择一种培养基为基本培养基。 b确定培养基中各种激素的浓度及相对比例 B配方： MS基本培养基＋ 1mg/L 2,4-D＋0.5mg/L 6-BA＋0.7％琼脂＋3％蔗糖 C配制体积： 每小组配制0.5L，每人用100ml三角瓶分装5瓶，每瓶约装25ml培养基。 (2)胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制步骤 A. 药品及用具的准备 B. 培养基配制 C. 调节培养基的酸碱性至pH5.8 D. 培养基的分装 E. 培养基的灭菌 F. 无菌蒸馏水和接种工具准备 （3）接种前准备工作 A外植体表面灭菌前的准备工作 a 接种室的清洁和消毒以及超净工作台的开机和消毒： 10min 超净工作台消毒（75%酒精）, 紫外灯+风机 关紫外灯，并保持风机吹风状态；将各组的培养基，无菌水、解剖刀、镊子等操作工具放到超净台上，并进行消毒待用。 b消毒溶液、无菌水、装材料的容器、解剖刀、镊子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备。 c配置消毒溶液： 1.5g HgCl2 +1000ml蒸馏水，配置成0.15%的HgCl2。（1000毫升的2份） B 实验材料的准备 a 准备新鲜健康的胡萝卜肉质直根作实验材料； b 实验材料的修整、刷洗、冲洗； c 用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水冲净。 每组1~2根胡萝卜，用试管刷和肥皂洗净，进行初次表面清洁；洗净后用干净的烧杯盛放，用小刀切成合适大小的4段（每人1段），转入超净台待用。 （4）植物材料的表面灭菌和接种 ①操作人员洗手消毒 ②装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒 ③将待消毒的材料浸入75％的酒精中10秒，取出转入无菌水冲洗干净。（酒精单独一个杯子装，消毒完毕转下一组使用） ④将无菌水倒出，并倒入消毒剂（ 0.15 %HgCl2 ）并计时20分钟；（同一瓶子中操作即可，但注意不要碰到瓶口等关键部位） ⑤到预定时间（20分钟）后，倒出消毒液，并用无菌水清洗4遍，保证消毒液全部清洁干净。 ⑥将洗净的材料用灭过菌的镊子夹出，放到干净的滤纸上吸干水分，并在滤纸上操作后续步骤； ⑦将已表面消毒的材料，从正中间竖直一分为2，然后切去表层，再切成扇形大小的方块，厚度约0.6cm左右，不要太薄。 ⑧材料切块后接种到诱导培养基上。（每瓶培养基放3~5块材料即可，材料不要过于集中） （5）胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制 A配方： MS基本培养基＋ 2mg/L NAA＋0.1mg/L 6-BA＋200mg/L水解酪蛋白＋ 0.7％琼脂＋3％蔗糖 B配制流程：（胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制） a) 药品及用具的准备 b) 培养基配制 c) 调节培养基的酸碱性至pH5.8 d) 培养基的分装 e) 培养基的灭菌 f) 无菌蒸馏水和接种工具准备 （6）胡萝卜愈伤组织的继代培养 A继代培养前准备工作 a) 接种室的清洁和消毒； b) 超净工作台的开机和消毒； c) 剪刀、镊子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备； d) 实验材料的准备（选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于净工作台上） B愈伤组织继代培养 将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体产生的愈伤组织在已灭菌的培养皿中剥离 将剥离的愈伤组织转接到愈伤组织增殖培养基上，封好封口膜
将培养瓶放置在25 ℃全黑暗条件下进行愈伤组织的增值培养。 (7) MS基本培养基母液和常用试剂的配制 母液的配制方法：1）、配制成单一化合物母液。此法适合配制多种培养基都需要的同一母液。 2)、配成几种不同的化合物的混合母液。此法适用在大量配制同种培养基时省时省力。 配好的母液应放在试剂瓶中储存。 在配制MS培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的顺序，以免发生沉淀。通常把每种试剂单独溶解后再与别的已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物。混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把Ca2+与SO42+和PO43错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物。同时，—要慢慢地混合，边混合边搅拌。 1）、大量元素母液的配制 MS培养基中的大量元素除C、H、O外，剩下的六种可由KNO3、NH4NO3、CaCl2·2H2O、MgSO4·7H2O、KH2PO4几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中。配制的步骤为：称量 分别溶解 装瓶 贴标签 放入冰箱保存。 注意：CaCl2·2H2O最后加入。 母液成分 大量元素 大量元素 KNO3 NH4NO3 CaCl2·2H2O MgSO4·7H2O KH2PO
成分 规定用量/mg·L1—扩大倍数 母液定容体积/L 称取量/mg 配1LMS培养基吸取量/ml 20 0.5 19000 50 KNO3 1900 1900 1650 440 370 170 20 0.5 19000 16500 4400 3700 1700 50