常见生理指标测定方法（新版）
常见生理指标测定用方法
――SOD、POD、CAT、可溶性蛋白、叶绿素、电导率、可溶性糖、MDA、脯氨酸、叶片含水量
SOD酶液可用于SOD、POD、CAT、可溶性蛋白指标的测定，即POD、CAT、可溶性蛋白三个指标不用再取叶片。
SOD酶液的提取。每个重复称取去叶脉的叶片组织约0.25g。剪碎放入预先冷却好的研钵中，加入少量(2-3 ml，因总体积只有9 ml，还要冲洗2次)的磷酸缓冲液(0.05 mol/L，PH=7.8)（不加PVP）研磨成匀浆，然后倒入10 ml的带刻度的塑料离心管中（预先洗好晾干），并用此磷酸缓冲液定容到9 ml。在3000转，4℃高速离心机（提前4℃预冷一下，设好4℃后提前空转运行一下）中离心15分钟，将提取的酶液放入置有冰袋的塑料盒中，低温保存，备用。宜用酶液将4个指标当天测完，切记。
实验一 氮蓝四唑(NBT)法测定SOD活力（优先1-用材0.25 g）
1. 实验原理
超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶，它的反应产物可由过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。
本实验依据超氧化物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生超氧阴离子自由基，超氧阴离子自由基可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560 nm处有最大吸收。而SOD可清除超氧阴离子自由基，从而抑制甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。 2. 材料、仪器设备及试剂 （一）材料
叶片。 （二）仪器设备
高速台式离心机，分光光度计，微量进样器（要注意测试一下是否准确，用玻璃移液管来对比），荧光灯（反应试管处照度为4000 lx），我们用的光照培养箱，33%的光照下，上数第二个架子中间位置为4000 lx。试管。 （三）试剂
（1）0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8）。 注：PBS（磷酸缓冲液）配制
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母液：A液：0.2 mol/L Na2HPO4溶液： Na2HPO4.12 H2O 71.63 g定容至1000 ml; (计算步骤：358.14*0.2=71.628 g)
B液：0.2 mol/L NaH2PO4溶液：NaH2PO4. 2 H2O 31.20 g定容至1000 ml; (计算步骤：156.01*0.2=31.202 g)
0.05 mol/L pH=7.8 PBS：A液取114.38 ml，B液取10.63 ml，将A与 B液混合并用蒸馏水定容至500 ml.（详见李合生版《植物生理生化实验原理和技术》P267）
（2）130 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399 g Met用0.05 mol/L PBS定容至100ml。
（3）750 μmol/L氮蓝四唑溶液：称取0.0613 g （精确到最后一位，相差不要超0.0003 g）NBT用磷酸缓冲液定容至100 ml，4℃冰箱中，置于棕色瓶中避光保存。
（4）100 μmol/L EDTA-Na2溶液称取0.0372 g EDTA-Na2，用0.05 mol/L PBS磷酸缓冲液定容至1000 ml。
（5）20 μmol/L核黄素溶液：称取0.0753 g核黄素用蒸馏水定容至1000 ml。 （注：核黄素现用现配，不用时严格避光保存，放在棕色瓶中，切记） 3. 实验步骤 1) 酶液提取
称取去叶脉的叶片组织约0.2500 g（精确到小数点后两位），剪碎放入预先冷却好的研钵中，加入少量的磷酸缓冲液(0.05 mol/L，pH=7.8)（不加PVP）研磨成匀浆，然后倒入10 ml的离心管(带刻度)中，并用此磷酸缓冲液定容到9 ml。在3000 r/min，4℃高速离心机中离心15分钟（离心务必澄清，否则再离一次），将提取的酶液放入冰箱中，4℃低温保存。
2) 反应混合液的配置(根据测定样品现配，如50或100个样品用量)
每支试管中各溶液显色反应用量：0.05 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.8），1.5 ml；130 mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液，0.3 ml；750 μmol/L氮蓝四唑溶液，0.3 ml；100 μmol/L EDTA-Na2溶液，0.3 ml；蒸馏水，0.10 ml；以上总计2.50 ml。
根据样品的量配制反应混合液。 3) 显色反应
取5 ml指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，每支加入2.50 ml的反应混合液，然后向对照管中加入0.20 ml（200 μl）的0.05mol/L磷酸缓冲液（pH7.8）；向测定管管中加入0.20 ml（200 μl, 酶液用量可以调整，夏枯草采用200 μl）的酶液，然后再迅速向四支试管中分别加0.3 ml的20 μmol/L核黄素溶液。
混匀后将1支对照管置暗处，其他各管于4000 lx日光下（置于2#209实验室靠门侧光照培养箱由上往下第二层正中心位置，33%光照度）反应20 min（要求各管受光情况一致，温度高，时间缩短，低时延长）。
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注：反应结束应立即测定，以防数值出现较大偏颇。
4) SOD活性测定
反应结束后，以不照光的对照管作空白，在560 nm处，分别测定其他各管的吸光度（在测定中测定管与吸收管应该比对照管的吸光度值降低）。 4. 结果计算
已知SOD活性单位以抑制NBT光还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。
(ACK?AE)?VSOD总活性(U/g)?0.5?ACK?W?VT 式中：SOD总活性以每克样品鲜质量酶单位表示(U/g)，ACK为对照管的吸光度AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积；VT为测定时样品用量(mL)；W为叶片的鲜重(g)。
实验二 过氧化物酶POD活性的测定 （优先1-用材0.25 g，同SOD酶液)
1. 实验原理
在过氧化物酶POD的催化下，过氧化氢将愈创木酚氧化为茶褐色产物，此产物在470 nm有最大光吸收,因此测定470 nm的吸光度变化就可得到过氧化物酶的活性。
2. 材料、仪器设备及试剂
1)材料
新鲜芍药叶片 2)仪器设备
722型分光光度计，离心机，研钵，容量瓶 3)试剂
(1) 0.05 mol/L，pH=6.0的磷酸缓冲液（用于反应混合液的配制） 注：PBS（磷酸缓冲液）配制
母液：A液：0.2 mol/L Na2HPO4溶液： Na2HPO4.12 H2O 71.62 g定容至1000 ml; B液：0.2 mol/L NaH2PO4溶液：NaH2PO4. 2 H2O 31.2 g定容至1000 ml;
0.05 mol/L pH=6 PBS：A液取15.375 ml，B液取109.6 ml，将A与B液混合并用蒸馏水定容至500 ml（详见李合生版《植物生理生化实验原理和技术》P267）。
(2) 愈创木酚 (3) 30%过氧化氢
3. 实验步骤
(1) 取两支试管，一只为对照管，一只为试验管。将提取的SOD酶液取1 ml加入到实验管中，对照管加1 ml蒸馏水。将两支试管都放在室内自然上升至室
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温(约25摄氏度，最好当天测完)。
(2) 然后在对照管和实验管中分别加入3 ml反应混合液(反应混合液包括：0.05 mol/L，pH=6.0的磷酸缓冲液100 ml，加愈创木酚56 μl，待加热完全溶解后，看不到有愈创木酚液滴方行。然后冷却至室温，加入30%过氧化氢38 μl，以防H2O2分解)。然后摇匀，立即在470 nm测定POD的活性（在测定中吸光值应该不断升高）。
4. 结果计算
以每分钟ΔA470变化0.01为一个POD活性单位(U)
?A470?VT
W?VS?0.01?t式中：ΔA470为反应时间内吸光度的变化；t为反应时间(min)；VT为提取酶液总
POD活性[U/(g?min)]?体积(mL)；VS为测定时所用酶液体积(mL)；W为叶片的鲜重(g)。
实验三 过氧化氢酶CAT测定（优先1-用材0.25 g，同SOD酶液)
（要用752S测定）
1. 实验原理
过氧化氢在240 nm下有强烈吸收，但过氧化氢酶可分解过氧化氢使反应溶液吸光度发生改变，可根据测定吸光度的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
方法参考：赵世杰与苍晶的书：植物生理学实验指导（230页）。 2. 材料、仪器设备及试剂
1)材料
新鲜植物叶片 2)仪器设备
752 S型紫外可见分光光度计，离心机，研钵，容量瓶 3)试剂
(1) 0.2 mol/L磷酸缓冲液(PH=7.8，0.05 mol/L) (2) 30%过氧化氢
(3) 过氧化氢(0.1mol/L)
30%过氧化氢的摩尔浓度为9.8 mol/L（1.11*1000*0.30/34=9.79 mol/L），
0.1 mol/L过氧化氢配制：1.02 ml 30%过氧化氢稀释到100 ml蒸馏水中。
3. 实验步骤
1）酶液提取
采用前SOD酶液 2）酶活性测定
用0.2 mol/L pH 7.8的磷酸缓冲液（PBS）调零。 对照管（S0）：0.2 ml的酶液（预先在沸水中放1分钟，以煮死酶液，煮时用
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保鲜膜密封），冷却后，再加1.5 ml pH 7.8的0.2mol/L磷酸缓冲液（PBS），再加1 ml 的蒸馏水与0.3 ml 0.1 mol/L的过氧化氢。 测定管（S1与S2，两个重复）：0.2 ml的酶液（未煮死酶液，），加1.5 ml pH 7.8的0.2mol/L磷酸缓冲液（PBS），再加1 ml 的蒸馏水，加入0.3 ml 0.1 mol/L的过氧化氢后立即计时，迅速倒入石英比色杯中，在波长240 nm下测定吸光值，每隔1分钟读数1次，测定3分钟。待3支管全部测定完后，代入公式，计算酶活性。
4．结果计算。以1分钟内A240减少0.1的酶时为1个酶活单位（U）。
过氧化氢酶活性=(ΔA240 ×Vt) / (0.1 × V1 ×t × W)
ΔA240=Aso-(As1+As2)/2
Aso：加入煮死酶液的对照管的吸光值；As1与As2为2个样品测定管的吸光度值；Vt为酶液总体积，ml（我们的体系为9 ml）；V1为测定用酶液体积，ml（0.2 ml）;W为样品鲜重，g；0.1 为A240每下降0.1为1 个酶活性单位，U；t为加过氧化氢到最后一次读数的时间，min（3 min）。
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