常见生理指标测定方法（新版）
算出MDA浓度C(μmol/L)，进一步算出单位重量鲜组织中 MDA 含量(μmol/g)。式中，A532和A600分别表示532 nm和600 nm处的吸光度值。L为比色杯厚度(cm)
需要指出的是，植物组织中糖类物质对MDA-TBA反应有干扰作用。为消除这种干扰，经试验，可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。
C(μmol/L)=6.45(A532－A600)－0.56A450 （2）
A450、A532、A600分别代表离心后的溶液在450 nm、532 nm、600 nm波长下的吸光度值，进一步算出其在植物组织中的含量。 2．实验仪器、材料、试剂 （一）实验仪器
研钵，恒温水浴锅，分光光度计，冷冻离心机，天平，刻度试管。 （二）材料
植物新鲜叶片 （三）试剂
1）5%三氯乙酸（TCA)：称取5.0 g的三氯乙酸溶于蒸馏水并用其定容至100 mL
2）0.67%硫代巴比妥酸(TBA)：称取硫代巴比妥酸0.67 g溶于10％TCA溶液中(70度水浴加热，提前配，避光保存，即棕色瓶中)，并用其定容至100 mL。 3．实验步骤
1）酶液的提取 称取0.25 g的芍药叶片，加入提取液5%三氯乙酸（TCA)研磨均匀后，定容至5 ml，3000 r/min下离心10分钟。
2）吸取上清液2 ml并加入2 ml 0.67%硫代巴比妥酸(TBA)摇匀，在沸水中煮沸30分钟，冷却后再离心一次。
4）以2 ml的提取液和2 ml反应液0.67%硫代巴比妥酸(TBA)的混合液为对照，分别在450 nm、532 nm、600 nm的波长下测定吸光度值并记录数据。按
公式 C(μmol/L)=6.45(A532－A600)－0.56A450 （2）
计算植物样品提取液中丙二醛的浓度。
实验十 脯氨酸含量的测定(优先6-用材0.25 g)
1. 原理
用磺基水杨酸提取植物样品时，脯氨酸便游离于磺基水杨酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加热处理后，溶液即成红色，再用甲苯处理，则色素全部转移至甲苯中，色素的深浅即表示脯氨酸含量的高低。在520 nm波长下比色，从标准曲线上查出（或用回归方程计算）脯氨酸的含量。
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2. 材料、仪器设备及试剂
（一）材料：待测植物（水稻、小麦、玉米、高粱、大豆等）叶片。
（二）仪器设备：1) 722型分光光度计；2) 研钵；3) 100 ml小烧杯；4) 容量瓶；5) 大试管；6) 普通试管；7) 移液管；8) 注射器；9) 水浴锅；10) 漏斗；11) 漏斗架；12) 滤纸；13) 剪刀。
（三）试剂
1) 酸性茚三酮溶液：将1.25 g茚三酮溶于30 ml冰醋酸和20 ml 6 mol/L磷酸中(0.025*6*98/0.85/1.69=10.23ml，10.23 ml 85%的磷酸定容到25 ml容量瓶中)，搅拌加热（70℃）溶解，贮于冰箱中(现在现配，放置超24 h即重配)；
2) 3％磺基水杨酸：3 g磺基水杨酸加蒸馏水溶解后定容至100 ml；3) 冰醋酸；4) 甲苯。
3. 实验步骤
1) 标准曲线的绘制
（1）在分析天平上精确称取25 mg(0.0250 g)脯氨酸，倒入小烧杯内，用少量蒸馏水溶解，然后倒入250 ml容量瓶中，加蒸馏水定容至刻度，此标准液中每ml含脯氨酸100 μg。
（2）系列脯氨酸浓度的配制：取6个50 ml容量瓶，分别盛入脯氨酸原液0.5，1.0，1.5，2.0，2.5及3.0 ml，用蒸馏水定容至刻度，摇匀，各瓶的脯氨酸浓度分别为1，2，3，4，5及6 μg/ml。
（3）取6支试管，分别吸取2 ml系列标准浓度的脯氨酸溶液及2 ml冰醋酸和2ml酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加热30 min。
（4）冷却后各试管准确加入4 ml甲苯，振荡30 s，静置片刻，使色素全部转至甲苯溶液。
（5）用注射器或吸管轻轻吸取各管上层脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液为空白对照，于520 nm波长处进行比色。
（6）标准曲线的绘制：先求出吸光度值（Y）依脯氨酸浓度（X）变化的回归方程式，再按回归方程式绘制标准曲线，计算2 ml测定液中脯氨酸的含量（μg/ml）。
2) 样品的测定
（1）脯氨酸的提取：准确称取不同处理的待测植物叶片各0.25 g，分别置于大试管中，然后向各管中分别加入5 ml 3％的磺基水杨酸溶液，在沸水浴中提取10 min（提取过程中要经常摇动），冷却后过滤于干净的试管中，滤液即为脯氨酸的提取液。
（2）吸取2 ml提取液于另一干净的带玻塞试管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮试剂，在沸水浴中加热30 min，溶液即呈红色。
（3）冷却后加入4 ml甲苯，摇荡30 s，静置片刻，取上层液至10 ml离心管中，在3000 rpm下离心5 min。
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（4）用吸管轻轻吸取上层脯氨酸红色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯为空白对照，在分光光度计上520 nm波长处比色，求得吸光度值。 4. 结果计算根据回归方程计算出（或从标准曲线上查出）2ml测定液中脯氨酸的含量（μg/ml），然后计算样品中脯氨酸含量的百分数。计算公式如下：
脯氨酸含量（μg/ml）＝(X×5/2)/(样重*106) 式中X为从标准曲线中查得脯氨酸浓度。
注意事项：1）甲苯有毒，做实验时门窗要开着通风，做完实验最好把废液倒入厕所。
2）茚三酮不要沾染到手上，尽量戴手套，否则沾上洗不掉。
3）本实验药品很多都有刺激性和毒性，做实验时尽量戴口罩小心操作。
实验十一 叶片相对含水量的测定(暂不测)
先求叶片鲜重Wf(取0.20 g，最好0.5 g以上)，然后将叶片浸入蒸馏水中数小时，使叶片吸水成饱和状态。取出用吸水纸吸取表面的水分，立即放入已知重量的称瓶中称重，再放入蒸馏水中一段时间后取出吸干外面水分，再称重，直至重量不再增加为止。此时即为叶片吸水饱和时的重量Wt，再将样品烘干，求得组织干重Wd，
即得相对含水量=（Wf-Wd）/（Wt-Wd）×100%
注：Wf——叶片鲜重（g）；Wd——叶片干重（g）；Wt——叶片饱和吸水重（g）。
一般认为24小时，叶片吸水以及达到饱和状态，没有必要继续。时间长了，叶片可能有所变化吧。烘干8小时，测重量。
注意事项：1、测含水量时要用刚采摘的新鲜叶片。 2、要烘干至恒重。
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