2.7胶原多肽水凝胶的表征 2.7.1表征测试方法
明胶组成的分析 蛋白含量测定参照GB/T5009.5-2003第一法，换算系数为5.79 ；水分测定参照 GB/T5009.3-2003恒重法；灰分测定参照GB/T5009.4-2003的灼烧法。 A 等光点的测定 荧光/黏度法[21]
用荧光光度计比较相同pH时明胶和纯酪氨酸的荧光光谱。仪器参数设置为：激发波长Eb=277nm，发射波长Em=306nm；温度：25℃；所用液池：1cm石英比色皿。同等条件测定不同pH下明胶荧光强度，测定不同pH下浓度为1%（w/v ）的明胶溶液的黏度值，计算公式如下：
η=k*α
式中：η为绝对黏度（mPa·s）；k为系数；α为指针读数。 浊度/分光光度法测定等电点[22]
配制3ml 0.1mol/L pH分别为 4.5、4.7、4.8、4.9、5.0、5.4、5.7、5.8、5.9、6.0、6.3的系列缓冲液，置于不同试管，分别加入1mL 1%（w/v）明胶溶液，摇匀；滴加相同体积的无水乙醇，直至出现浑浊；用分光光度计测定400nm和600nm处的吸光度值。 B 评价指标
水解度测定Ph-stat[19]法；多肽得率计算公式为：
多肽得率（%）= （上清液中多肽含量/样品中的总氮含量）×100% 样品中总氮含量采用微量凯氏定氮法测定，多肽含量测定采用三氯乙酸沉淀C 胶原多肽的傅里叶红外分析
采用溴化钾压片法，取适量干燥样品混合KBr在玛瑙钵中轻轻研磨均匀，在500～4000cm-1之间扫描，分辨率为4cm-1，扫描次数为32次。
2.7.2实验结果与讨论
A 明胶成分分析
明胶成分分析说明本实验所用的明胶达到国家标准A级水平，且蛋白含量高，是胶原多肽的良好来源。
表2-3 明胶成分分析
精品
含量 国家标准
B 明胶等电点的测定
蛋白质 84.67 -
水分 12.65 ≤14
灰分 1.55 ≤1
黏度荧光分析法 如图2-1所示，明胶和纯酪蛋白的荧光光谱非常一致，在306nm处均有一个荧光峰，最大激发峰为277nm，这是酪氨酸的特征光谱。二者的微小区别在于，对应与激发光谱中的第一激发峰即羰基的K吸收带，明胶的峰强度较低，这是由于羰基参与形成肽键的缘故，说明测定明胶的荧光强度时可以酪氨酸为基准。
图2-1 纯酪氨酸和明胶荧光光谱图
在25℃，Ex=277nm和Em=306nm的条件下，测得不同 pH明胶的荧光强度和黏度值如图2-2 所示。由图可知，pH4.5-4.8范围明胶黏度最低，偏离此范围均有黏度最大值出现；明胶的荧光强度在pH4.5-4.8范围出现极大值，这是因为在等电点处，明胶分子收缩和侧链基团相互作用所引起。分析表明明胶等电点在pH4.5-4.8范围，同时也说明该明胶是以动物皮、骨、腱为原料碱水解方法合成而得。
精品
图2-2不同pH下明胶溶液的粘度和荧光值
C 浊度分光光度法
由图2-3可知，加入乙醇后明胶在400nm的吸光度较600nm处大，并且在pH4.60处明胶溶液最浑浊，吸光度最大，OD400和OD600分别为0.218和0.103。
图2-3加入乙醇后吸光度与pH的关系
综合分析上述两种方法，确定明胶等电点为pH4.5-4.6。 D 胶原多肽水解条件的确定
由表2-4结果可知，影响多肽得率因素的次序为RA﹥RC﹥RB，最佳条件为
A3B3C1；影响水解度因素的次序为R′C﹥ R′A﹥ R′B，最佳条件为A3B3C3。进行方差分析后可知（方差分析表略），影响多肽得率的显著因素是A(温度），因素B
精品
和C对两个指标影响均不显著。综合考虑两指标同时提高的原则，确定最佳工艺条件为A3B3C1。为检验正交实验结果，进行了验证实验，测得多肽得率为85.38%，水解度为45.87%。
精品
表2-4 正交试验结果
E 胶原多肽的傅里叶变换红外光谱分析
图2-8 红外光谱分析可知，3200～3500cm-1之间3246.87cm-1的强吸收归属于酰胺A带的N-H的伸缩振动（氢键）峰；3066cm-1处的弱吸收为酰胺 带的C-N伸缩振动引起的特征吸收峰。一般认为在3080cm-1附近是多肽（-CONH-）的特征吸收，而2962.31cm-1出现的吸收峰恰好说明胶原多肽具有多肽特征.1641.14cm-1的强吸收峰属于酰胺Ⅰ带，是由蛋白多肽骨架的C=O伸缩振动所引起的。1455.24cm-1属于胶原多肽氨基酸残基的侧链基团，应是苯环骨架振动造成的，说明有苯环存在。由于胶原多肽的甘氨酸和特征氨基酸羟脯氨酸和脯氨酸含量高，且形成独特的（Gly-Pro-Hyp）n[20]序列，这使得胶原多肽在1200～1400光谱范围内具有其他蛋白质所没有的红外光谱特征，1244.03cm-1和1338.15cm-1归属于酰胺Ⅲ带，是由C-N伸缩振动和N-H弯曲振动引起的；胶原多肽的特征氨基酸Hyp的特征吸收在1107.38cm-1和847.92cm-1被表征出来，说明胶原多肽具有胶原和蛋白多肽的双重特征。
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