应该获得仪器对分析物的响应水平，并且应该在适当的浓度范围内进行标准曲线评价。通过加入已知浓度的分析物（和内标）到空白基质中，获得各浓度的标准曲线样进行预处理，其基质应该与目标试验样品基质相同。方法验证中每种分析物和每一分析批，都应该有一条校正曲线。
用于配制标准曲线和质控样品储备液的标准物质应分别称量。二者的准确度应接近。评价标准曲线和质控样品储备液浓度接近程度的参考方法：将标准曲线和质控样品的储备液分别稀释至相当于中浓度质控样品浓度的溶液，加入内标后，连续进样。评价标准为：二者连续进样，各自与内标比值的变异应小于5%；二者的偏差小于5%。若整个试验样品测定过程中多次称量和配制储备液，应分别提供每次称量的上述比较结果。
校正曲线范围应该覆盖预期浓度范围，即LLOQ（标准曲线样的最低浓度）至 ULOQ（定量上限，标准曲线样的最高浓度）的范围。该范围应足够描述分析物的药动学特征。一般建议LLOQ不高于预期血药浓度峰值Cmax的10%，ULOQ应当至少为预期血药浓度峰值Cmax的两倍。应当使用至少6个校正浓度水平，标准曲线应有空白样品(不含分析物和内标的处理过的基质样品）和零浓度样品（含内标的处理过的基质），空白样品和零浓度样品不参与标准曲线的拟合计算。
建议每个分析批采用双标准曲线拟合方式，即标准曲线样平行处理2份。若无特殊原因，每条标准曲线应从低浓度至高浓度依次进样。标准曲线样的计算浓度偏差，LLOQ应在±20%以内，其余应在标示值的±15%以内。应该使用简单且足够描述仪器对分析物浓度响应的方程式，最少6个标准曲线样参与标准曲线的拟合，至少75%的标准曲线样应满足上述标准，如果某个标准曲线样结果不符合这些标准，应该拒绝这一标样，不含这一标样的标准曲线应被重新进行回归分析和评价；两份标准曲线样应同时拟合得到一条标准曲线用于该分析批的定量。一般以待测物峰面积AS和内标峰面积AIS的比值?（?=AS/AIS）为y，待测物浓度为x，取适当的权重（如1/x2）采用加权最小二乘法进行线性回归，拟合标准曲线方程（校正方程），相关系数r的平方（r2）建议不小于0.9900。
在方法验证中，至少应该评价3条标准曲线。最好使用新鲜配制的标准曲线样建立标准曲线，但如果有稳定性数据支持，也可以使用预先配制并储存的标准曲线样。每个标准曲线样可以被多次处理和分析。应该提交标准曲线参数（包括权重、斜率、截距、相关系数r或r2），测定标准曲线样后回算得出的浓度及相应偏差应一并提交。
7.5 准确度
分析方法的准确度描述该方法测得值与分析物真实浓度的接近程度。应采用加入已知量分析物的样品（即QC样品）来评估准确度，并应该根据标准曲线分析QC样品，将计算值与标示值对比，表示为即标示值的百分比，表示为（测得值-真实值）/真实值×l00%，即计算值与标示值的偏差表示。
在方法验证时，应通过至少4个浓度水平，包括LLOQ、LQC、MQC和HQC，每个浓度至少5个测定样品分析来确定准确度。浓度水平应在校正曲线范围内：在LLOQ浓度3倍之内的低浓度QC（LQC），标准曲线的中间浓度 QC（MQC），以及校正曲线范围上限约75%处的高浓度QC（HQC）。应通过单一分析批（批内准确度）和不同分析批(批间准确度)获得质控样品值来评价准确度。
（1）批内准确度
为了验证批内准确度，应取一个分析批的LLOQ、低、中、高浓度QC水平，每个浓度至少用5个样品，每个浓度水平所有样品偏差的均值在±15%之内，LLOQ应在±20%以内。若有质控样品响应异常，应在统计计算中剔除，剔除后该浓度水平的QC样仍应满足至少5个测定值的要求。
（2）批间准确度
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通过至少两个不同天的3个分析批，每批在LLOQ、低、中、高浓度 QC 样品的每个浓度至少5个测定值来评价。计算所有有效分析批的QC样品标示值的偏差应在±15%范围内，LLOQ应在标示值的±20%范围内。
报告的准确度和精密度的验证数据应该包括所有获得的测定结果，但是已经记录明显失误的情况除外。
为评价一个分析批中不同时间的任何趋势，应在方法验证阶段确定分析批大小（batch size），建议以不少于一个分析批预期样品数的QC样品数进行批内准确度考察。原则上，未知样品的分析批不应大于方法验证分析批。
7.6 精密度
分析方法的精密度描述分析物重复测定的接近程度。精密度用相对标准差（变异系数，%CV或%RSD）表示。应使用与证明准确度相同分析批样品的结果，获得在同一批内和不同批间LLOQ以及低、中、高浓度QC样的精密度，每个浓度至少5个样品，批内变异系数值不得超过15%，LLOQ不得超过20%。对于验证批间精密度，至少需要两个不同天的3个分析批。
报告的准确度和精密度的验证数据应该包括所有获得的测定结果，但是已经记录明显失误的情况除外。
7.7 基质效应
当使用质谱方法时，应该考察基质效应。使用至少6批来自不同个体的空白基质，不应使用合并的基质，分别在低、中、高浓度下进行。如果基质难以获得，则使用少于6批基质，但应该说明理由。
对于每批基质，应该通过计算基质存在下的峰面积Amx（由空白基质提取后加入分析物和内标测得），与不含基质的相应峰面积的平均值Asol,mean（分析物和内标的纯溶液）比值，分别计算每一分析物和内标的基质因子（Matrix factor，MF）：
MF(%)=Amx/Asol,mean×100%
内标纯溶液的峰面积均值是指所有纯溶液的内标峰面积均值。若低、中、高浓度的变异系数值≤15%，则认为基质效应可以接受。
待测物的基质因子除以内标的基质因子，计算经内标归一化的基质因子（ISnorm-MF）：
MFIS-n(%)=MFdrug/MFIS×100%
MFIS-n的变异系数应≤15%，则认为基质效应可以接受。如果不能适用上述方式，例如采用在线样品预处理的情况，则应该通过分析至少6批基质，分别加入高、中、低浓度待测物来获得批间响应的变异。其验证报告应包括分析物和内标的峰面积，以及每一样品的计算浓度。这些浓度计算值的总体变异系数不得大于15%。
必要时考察待测物在特殊基质中的基质效应，如溶血血浆、高脂血浆等，基质效应考察方法和接受标准与正常基质相同。
7.8 稳定性
稳定性评价是为了确保样品采集、分离、预处理、运输、和检测的每一步骤，以及使用的储存条件，都不影响分析物的精密度和准确度。稳定性评价包括待测物和内标在溶剂、生物基质及预处理等过程中的稳定性考察。文献报道的数据不可以用于证明稳定性，但可以作为稳定性实验设计的参考依据。
7.8.1 溶剂稳定性
待测物和内标在溶剂中的稳定性，指储备液和工作液在储存和使用条件下的稳定性（长期和短期稳定性），以待测物和内标的峰面积比值作为评价指标。如有必要，不同材质的承装容器（如玻璃瓶或聚丙烯离心管）对待测物和内标稳定性的影响也应进行考察。待测物或内标储备液和工作液稳定性考察，采用新鲜配制或稳定期内的待测物或内标溶液作为参比，储备液一
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般要稀释至ULOQ和LLOQ浓度，得到参比溶液的待测物与内标峰面积比值记为?0（AS/AIS）；保存储备液或工作液也参照参比样进行稀释并用新鲜或稳定期内的内标工作液进行预处理，得到的比值记为?x，通常认为?x与?0的偏差在±10%以内时可认为待测物储备液或工作液在该条件下稳定。内标溶剂稳定性的评价则以?'0（?'=1/?0, AIS/AS）为指标，方法与待测物溶剂稳定性考察方法相同，但是选用新鲜或稳定期内的待测物溶液作为参比，得到?'x，通常认为?'x与?'0的偏差在±10%以内可认为内标储备液或工作液在该条件下稳定。可以在方法验证方案中根据待测物或内标的特性制定接受标准。
7.8.2 全血稳定性
应考察待测物在全血中的稳定性，以支持临床全血样本采集、运输和储存条件，应根据实验室的相关SOP或分析验证方案中规定的方法进行考察，建议至少考察全血在室温条件下的稳定性。例如，采用新鲜的空白全血配制成低、中、高质控浓度的全血质控样品。取新鲜空白全血，加入药物工作液配制成低、高浓度的全血质控样品，轻轻反复颠倒混匀，然后置于37℃水浴中孵育，根据药物性质考察孵育时间。检测时将全血质控样品离心后取上层血浆进行预处理和分析，以0时刻（T0）检测浓度值或峰面积比值作为对照，根据方案中规定的偏差范围（如±20%）判断全血在该条件下的稳定性。若使用检测浓度作为评价指标，应至少有两个浓度水平的全血样品检测浓度值在线性范围内，若不足两个浓度水平，则应重新选择全血稳定性考察浓度以满足上述要求。
7.8.3 检测基质稳定性
待测物在检测基质中的稳定性考察，应至少考察以下几种条件：
（1）从冷库储存条件到室温，基质中分析物反复冻融的稳定性：QC 样品解冻后的样品在同样条件下重新冷冻。在每一循环，样品都应被冷冻 12 小时以上，然后解冻。反复冻融稳定性的循环次数一般不少于3次，应等于或超过试验样品的冷冻/融化循环次数。
（2）基质中分析物在室温实验台上的稳定性； （3）基质中分析物储存的长期稳定性；
（4）处理过的样品（如干燥提取物或沉淀上清液）在室温下或试验过程中的稳定性，如果适用；
（5）处理过的样品在自动进样器中的稳定性。 稳定性检查应考察不同储存条件，时间范围应不小于试验样品储存的时间。在多个分析物试验中，应该关注每个分析物在所有分析物基质中的稳定性。
用于稳定性考察的QC样品（简称稳定性样品）应视为未知样品进行检测，即需要随行新鲜或稳定期内的标准曲线和QC样品。根据校正曲线计算稳定性样品的浓度，若计算浓度与标示浓度的偏差应在±15%以内则认为稳定性样品稳定。
7.9 稀释可靠性
若血浆样品浓度高于定量上限时，应采用的空白血浆稀释后重新测定，应预考察稀释数倍的稀释可靠性。每个稀释浓度至少5个测定值。准确度和精密度应在±15%以内。稀释可靠性所选的稀释倍数应该覆盖试验样品所用的稀释倍数。可通过部分方法验证来评价稀释可靠性。需考察稀释样品的批内准确度和精密度。
7.10 提取回收率
配制低、中、高浓度的对照样和生物基质QC样品进行回收率考察。对照样采用基质效应样，QC样品进行预处理，每个浓度平行处理至少5份，进样分析并记录色谱图，对照样中分析物的峰面积记为S，QC样品中药物的峰面积记为C，最后，将上述C和 S代入下式即可分别求得分析物的提取回收率（R%）。内标的提取回收率计算方法与药物相同。
R(%)=C/S×100%
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低、中、高质控样品的提取回收率应尽量均一、精确和可重现。
7.11 系统耐用性
建议考察系统条件的变化对待测物和内标的影响，例如色谱柱、流动相、柱温、人员变动等，建议考察不同因素变化时精密度与准确度值，接受标准同精密度与准确度验证标准。 7.12 方法部分验证 部分验证（Partial Validation）适用于以下情况（不局限于此）：分析方法转移至另一实验室、改变仪器设备、校正浓度范围、样品体积、其他基质、改变抗凝剂、样品处理步骤和储存条件。应报告所有的改变，并对重新验证或部分验证的范围说明理由。
7.13 方法交叉验证 交叉验证（Cross Validation）适用于应用同一方法从不同试验地点获得数据，或者应用不同方法从一项或多项试验获得数据。如果可能，应在试验样品被分析之前进行交叉验证，同一系列质控样品或试验样品应被所在所有试验地点、应用的所有分析方法测定比较。对于质控样品，不同方法获得的平均准确度应在±15%范围内。如果放宽，应该说明理由。对于试验样品，至少67%样品测得的两组数值差异应在两者均值的±20%范围内。当需要测定多个分析物时（如两种不同的药物，或者一个母体药物及其代谢物，或一个药物的对映体或异构体等），生物分析方法验证和未知样品分析的原则适用于所有涉及的分析物。
8. 测量不确定度
根据检测的具体需要参照实验室相关文件（如SOP）对方法测量不确定度（Uncertainty of measurement）进行评估。
9. 试验生物样品分析
9.1 样品分析方案的制定
需要在试验样品分析开始前制定生物样品分析方案，确保样品分析过程中相关人员充分理解方案并具有相应操作能力。如果试验样品分析开始前，已知或预期试验样品中分析勿浓度范围窄，则推荐缩窄标准曲线范围，调整QC浓度，或者适当加入QC样品新的浓度，以充分反映试验样品的浓度。如果看起来很多样品分析物浓度高于定量上限，在可能的情况下，应该延伸标准曲线范围，加入额外浓度的QC样品或改变其浓度。如果标准曲线范围被改变，则生物分析方法应被重新验证（部分验证），以确认相应函数并保证准确度和精密度。当样品分析方案进行修订，发生变更时，应做好版本控制并及时培训相关人员，确定其知悉变更内容。
分析方案中要明确说明是否采用盲法检、生物样品预处理过程、分析批组成、标曲和QC的分布方法及进样顺序、分析批接受标准，ISR、低于定量下限的检测结果的表述；说明样品分析过程中发生的任何与方法验证所采用条件不同的情况的处理原则；说明是否进行部分方法验证。尤其要详细说明检测异常点/离群值/复测点等的判定原则。规定复测方法和复测结果的接受标准，即重分析的条件和报告数据的原则等。说明样品分析过程及数据的质量保证措施。 9.2 样品分析批
9.2.1 标准曲线和质控样品
一个分析批包括空白样品、零值质控样品、至少6个浓度水平的标准曲线样，至少3个水平的QC 样品（低、中、高浓度，若该分析批含有稀释的待测样本，应添加稀释质控样（DilutionQC，DQC），双重样品或至少试验样品总数的5%，两者中取数目更多者）以及被分析的试验样品。所有样品（标准曲线样、QC 和试验样品）应在同一样品批中被处理和提取。
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质控样品应该分散到整个批中，以保证整个分析批的准确度和精密度。分析批中应有考察残留的样品。至少两个质控浓度应该落在试验样品浓度范围内。
9.2.2 试验样品
建议一名受试者的全部样品在同一分析批中分析，以减少结果的变异。 9.2.3 分析批接受标准
应在样品分析方案或标准操作规程中，规定接受或拒绝一个分析批的标准。一个分析批若同时满足以下标准方可认为结果有效：
(1) 除LLOQ外，标准曲线样计算浓度应在标示值的±15%范围内，LLOQ应在±20%范围内。如果标准曲线样中有一个不符合这一标准，则应该拒绝这个标样，重新计算不含该标样的校正曲线，并应再进行回归分析。至少75%标准曲线样和至少 6个有效浓度满足上述标准。如果使用多重标准曲线样（例如“双标曲”），其中仅一个定量下限或定量上限标样不合格，则校正范围不变。线性标准曲线相关系数的r2不小于0.9900。
(2) QC样品的准确度应在标示值的±15%范围内。至少67%质控样品且每个浓度水平至少50% 样品符合上述标准，例如6个QC样品中至少4个满足要求。
在不满足上述标准的情况下，应该拒绝该分析批，相应的试验样品应该重新分析。在同时测定几个分析物的情况下，对每个分析物都要有一条标准曲线。如果一个分析批对于一个分析可以接受而对于另一个分析物不能接受，则接受的分析物数据可以被使用，但应该重新提取和分析样品，测定被拒绝的分析物。
所有接受的分析批，每个浓度质控样品的平均准确度和精密度应该列表，并在分析报告中给出。如果总平均准确度和精密度超过15%，则需要进行额外的考察，说明该偏差的理由。对于生物等效性试验，这可能导致数据被拒绝。
9.3 试验样品重新分析
应该在试验样品分析计划或标准操作规程中预先确定重新分析试验样品的理由、重分析方法（例如采用双样）以及选择报告值的标准。应该提供重新分析样品的编号、初始值、重新分析的理由、重新分析获得值、最终接受值以及接受理由。对于生物等效性试验，通常不能接受由于药动学理由重新分析试验样品。重新分析试验样品可能基于以下原因：
(1) 由于标准曲线样或质控样品的准确度或精密度不符合接受标准，导致一个分析批被拒绝；
(2) 内标的响应与标准曲线样和质控样品的内标响应差异显著，根据分析方案或标准操作规程中相关规定对响应异常进行判断。
(3) 进样不当或仪器功能异常。在仪器故障的情况下，如果已经在方法验证时证明了自动进样器内稳定性，则可以将已经处理的样品重新进样。但对于拒绝的分析批，则需要重新处理样品。
(4) 测得的浓度高于定量上限，或低于该分析批的定量下限，且该批的最低浓度标样从标准曲线中被拒绝，导致比其它分析批的定量下限高；
(5) 在给药前样品或安慰剂样品中测得可定量的分析物； (6) 色谱不佳。
10. 用于评价方法重现性的试验样品再分析（ISR）
10.1 ISR定义
在方法验证中使用标准曲线样和质控样品可能无法模拟实际试验样品。样品处理和储存过程中无法避免的诸多差异均可能影响方法的准确度和精密度，例如蛋白结合、已知或未知代谢物的回复转化、样品均一性和同服药物等差异。因此，推荐通过在已测分析批检测数天后，在
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