凝胶层析法测定蛋白质分子质量
一、 实验目的
1、了解凝胶层析的原理及其应用。
2、通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、 实验原理
凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关：Kav=（Ve-V0）/（Vt-V0）。
在限定的层析条件下，Vt和V0都是恒定值，而Ve是随着分离物分子质量的变化而改变。分子质量大，Ve值小，Kav值也小。反之，分子量小则Ve值大，Kav值大。
有效分配系数Kav是判断分离效果的一个重要的参数，同时也是测定蛋白质分子质量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质Kav值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出Vt、V0及Ve的值，从而计算出Kav的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的分子质量范围内，Kav和lgMr成线性关系： Kav = -blg Mr + C 其中b，C 为常数。
同样可以得 Ve = -b’ lg Mr + C’, 其中b'、C'为常数。可以通过在一凝胶柱中分离多种已知分子质量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其他未知蛋白的分子质量。 三、 器材和仪器 （一）器材
1、玻璃层析柱。 2、恒流泵。
3、自动部分收集器。 4、紫外分光光度计。 5、100ml试剂瓶。 6、1000ml量筒。 7、250ml烧杯。
8、50ml、100ml烧杯。
9、10ml（或5ml）刻度试管。 （二）试剂 1、标准蛋白
（1）牛血清白蛋白：Mr=67 000（上海生化所）。
1
（2）鸡卵清清蛋白： Mr =45 000（美国SIGMA公司）。 （3）溶菌酶： Mr =14 300。 2、未知蛋白样品
3、洗脱液0.025mol/L KCL~0.1 mol/L HAC 4、蓝色葡聚糖-2000。 四、 实验操作 （一）凝胶的溶胀
称取7g Sephadex G-75 于250 ml烧杯中加入洗脱液100ml，置于室温溶胀2~3天，反复倾泻去掉细颗粒，然后减压抽气去除凝胶孔隙中的空气，沸水浴中煮沸2~3小时（可去除颗粒内部的空气以及灭菌）。 （二）装柱
1、取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。 2、凝胶柱总体积（Vt）的测定：
在距离柱上端5cm出作一个记号，关闭柱出水口，加入去离子水，打开出水口，液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接受柱中去离子水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积Vt。也可以最后走完未知蛋白后再测定Vt。 3、 在柱中加入洗脱液（约1/3柱床高度），将凝胶浓浆缓慢倾入柱中，待凝胶沉积约1cm~2cm高度后打开出水口，流速一般用3~6ml/10min。胶面上升到柱记号处则装柱完毕，注意装柱过程中凝胶不能分层。然后关闭出水口，静置片刻，待凝胶完全沉降，则接上恒流泵，用1~2倍床体积的洗脱液平衡柱子，使柱床稳定。 （三）V0和未知蛋白Ve的测定
吸去柱上端的洗脱液（切不可搅乱胶面，可覆盖一张滤纸或尼龙网）。打开出水口，使残余液体降至与胶面相切（但不要干胶），关闭出水口。用细滴管吸取0.5ml（4.5mg/ml）蓝色葡聚糖-2000和未知蛋白（5mg/ml）的混合液，小心地绕柱壁一圈（距离胶面2mm）缓慢加入，然后迅速移至柱中央慢慢加入柱中，打开出水口（开始收集！），待溶液渗入胶床后，关闭出水口，用少许洗脱液加入柱中，渗入胶床后，柱上端再用洗脱液充满后用5~6ml/10min的速度开始洗脱，自动收集器收集时间为5min每管。最后作出洗脱曲线。收集并量出从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖浓度最高点的洗脱液体积即为V0。注意：蓝色葡聚糖洗下来之后，还要用洗脱液（1~2倍床体积）继续平衡一段时间，以备下步实验使用。 （四）标准曲线的制作
1、用洗脱液配制标准蛋白溶液供全班使用，溶液中三种蛋白的浓度各为：牛血清清蛋白（5mg/ml）、鸡卵清清蛋白（8mg/ml）、溶菌酶蛋白（4.5mg/ml）。
2、按（三）的操作方法加入上述标准蛋白溶液0.5ml，以5~6ml/10min的速度洗脱并收集洗脱液。
3、用紫外分光光度计逐管测定A280，并确定各种蛋白的洗脱峰最高点，然后量出各种蛋白的洗脱体积Ve。
4、以A280为纵坐标，Ve为横坐标画出标准蛋白的洗脱曲线。 5、以Kav为纵坐标，LogMr为横坐标作标准曲线。 6、以Ve为纵坐标，LogMr为横坐标作标准曲线。
7、在标准曲线上查出未知蛋白的LogMr，其反对数便是待测定蛋白质的分子质量。
注意，实验完毕后，将凝胶全部回收处理，以备下次实验使用，严禁将凝胶丢弃或倒入水池中。 五、 实验数据及处理 1、 实验原始数据：
2
1）Vt：φ=15.60mm；h=47.50cm。 2）吸光度A280数据:
表1-1吸光度A280数据
蓝色葡聚糖-2000+未知蛋白 A280 管数 1 0.169 2 0.164 3 0.164 4 0.205 5 0.171 6 0.162 7 0.162 8 0.164 9 0.160 10 0.165 11 0.348 12 1.242 13 0.611 14 0.358 15 0.274 16 0.239 17 0.239 18 0.293 19 0.436 20 0.597 21 0.644 22 0.545 23 0.492 24 0.282 25 0.213 26 0.182 27 0.17 28 0.162 29 0.167 30 0.163 2、 数据处理： 1）、凝胶柱床总体积Vt
标准蛋白 管数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 A280 0.168 0.166 0.161 0.162 0.161 0.160 0.161 0.161 0.163 0.158 0.162 0.210 0.394 0.357 0.308 0.334 0.374 0.358 0.301 0.247 0.212 0.209 0.272 0.411 0.567 0.620 0.479 0.353 0.236 0.172 0.133 0.118 0.110 0.108 3
Vt??4?2h?3.14?0.015602?0.4750m3?90.74ml 42）外水体积V0及未知蛋白洗脱体积Ve
作蓝色葡聚糖-2000和未知蛋白的洗脱曲线如图1-1所示。 1.400 1.200 1.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 0.05.010.015.020.025.030.035.0 3ml/管 图1-1蓝色葡聚糖和未知蛋白洗脱曲线
从图中可以查知，蓝色葡聚糖的洗脱峰处洗脱体积为36ml，即外水体积V0=36ml。未知蛋白的洗脱体积为63ml，即未知蛋白Ve=63ml。 3） 标准蛋白洗脱体积Ve
作标准蛋白的洗脱曲线如图1-2所示。 0.700 0.600 0.500 A280V()
A2800.4000.3000.2000.1000.0000.05.010.015.020.025.030.035.040.0V/(3ml/管)图1-2标准蛋白的洗脱曲线 4
从图中可以查知，标准蛋白的洗脱峰处洗脱体积分别为39ml、51ml、78ml。 由各标准蛋白分子质量：牛血清白蛋白：Mr=67 000（上海生化所）、鸡卵清清蛋白：Mr=45 000（美国SIGMA公司）、溶菌酶：Mr=14 300。
可知Ve（牛血清白蛋白）=39ml； Ve（鸡卵清清蛋白）= 51ml； Ve（溶菌酶）=78ml
4）各蛋白有效分配系数Kav和未知蛋白分子质量的计算。
各蛋白分子量、洗脱体积及有效分配系数Kav数据见表1-2
表 1-2各蛋白分子质量、洗脱体积及有效分配系数Kav数据
Mr LgMr Vt/ml V0/ml Ve/ml Kav 蛋白名称 牛血清白蛋白 67 000 4.826 39.0 0.055 鸡卵清清蛋白 45 000 4.653 51.0 0.274 90.74 36.0 溶菌酶 14 300 4.155 78.0 0.767 未知蛋白 63.0 0.493 由表中数据以Kav为纵坐标，LogMr为横坐标作标准曲线见图1-3。 以Ve为纵坐标，LogMr为横坐标作标准曲线见图1-4。 Kav-lgMr图y = -1.0463x + 5.1207 R2 = 0.99711.000 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 4.1004.2004.3004.4004.5004.6004.7004.8004.900 lgMr 图1-3 Kav-lgMr图 Ve-lgMr图 y = -57.274x + 316.3R2 = 0.9971 90.0 80.070.0 60.0 50.0 40.0 30.0 20.0 10.0lgMw 0.04.1004.2004.3004.4004.5004.6004.7004.8004.900 VeKav5 图1-4 Ve-lgMr图