在标准曲线Kav-lgMr上查出对应未知蛋白Ve=63.0，Kav=0.493的lgMr=4.420，由其反对数求得待测定蛋白质的分子质量Mr=26303。
六、 实验讨论
1、关于自动收集器每管收集量对实验结果影响的分析及改进措施。 在本实验中采用了5~6ml/10min的速度洗脱，自动收集器收集时间为5min一管。通过测定每管的吸光度来绘制洗脱曲线。这种处理方法本身存在方法误差，分析如下：
在本实验中，通过作洗脱曲线得到的V0=36ml，未知蛋白Ve=63ml，已知蛋白Ve分别为39ml、51 ml、78 ml。各体积数均为从作图的峰读出。但因为洗脱速度为5~6ml/10min，自动换管时间为5min，所以每管中溶液量为2.5~3ml，实际实验中是3ml/管。即相临数据点体积相差Δx=3ml。因为洗脱曲线是根据每个离散点用EXCEL处理得到的，我是直接用平滑线连接数据点的方式，没有采用趋势线。所以在这种处理过程中就可能造成因为数据点的“稀疏”而造成所做吸收峰位置偏差，其可能最大偏差值为Δx/2=1.5ml，我们假定实验过程中V0和已知蛋白Ve误差很小，而未知蛋白误差为±1.5ml，则可计算相对误差如下：
根据拟和得到的直线方程Ve=–57.274 lgMw + 316.3， 未知蛋白Ve=63.0ml，计算得lgMr=4.423，则Mr=26485 Ve=61.5ml，计算得lgMr=4.449，则Mr=28119
Ve=64.5ml，计算得lgMr=4.396，则Mr=24888
我们以上述三个值的平均值作为真值，则真值Mr=26497
由此计算可能相对误差为：?E?28119?26497?100%?6.12%。
26497 由计算结果我们可以看到相对误差很大，这种方法误差的来源是由于每管液量3ml过大造成的。实际在洗脱速度选定不变的情况下，我们完全可以通过减小自动收集间隔时间使洗脱峰由于曲线拟和的误差造成的偏移减小的方法减小这种误差。其代价是需要测定的总管数增加。在实际操作中我们可以在未出峰位置粗略测定几个点，而在出峰位置增加测定点的密度。
2、关于加样后加洗脱液引起的实验误差的分析。 加样操作过程产生的方法误差：因为加入样品后即开始收集，而我们最后计算洗脱峰位置是根据收集的管数乘以每管计算得到的设定收液体积。所以在样品渗入胶床后停止收集液体再加入少许洗脱液润洗管壁的时间内我们没有收集液体，但自动收集器仍在记时，所以该管液体量应该少于设定的每管收液体积。在数据处理过程中，我们对该管仍按设定的每管3ml计算。所以该时间段直接产生测量误差。其大小主要取决于操作者的熟练程度。所以我们在实验中应该尽量缩短该时间。 七、 实验思考题
1、简述凝胶层析分离生物大分子的原理。 答：凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶层析来分离生物大分子主要是根据多孔凝胶对近似于球形不同半径的生物大分子具有不同的排阻效应实现的。即是依据分子量的不同来进行分离的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大
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小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。
2、为什么在层析中,洗脱速度不能过快或过慢。
答：在层析过程中，存在一个最佳的洗脱速度，该速度下，理论塔板高度最小，从而增大理论塔板数，提高分辨率。如果流速过快，各组分在固液两相中的平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分形式流出。如果速度过慢，物质的扩散增大，区带变宽，使分辨率降低，不能达到理想的分离效果。同时会使实验时间延长。
3、简述温度对层析的影响。
答：温度对层析的影响主要是影响各组分在两相中的分配系数。有关系式：lnK=–ΔG0/RT。一般层析时的组分ΔG0为负值，所以温度与分配系数成反比。温度升高，分配系数下降，将导致组分移动速度增加，难以达到预期的分离效果。此时可以采用恒温柱的办法解决。此外有些时候也利用温度的这种效应来通过改变温度而实现增大K值，最终实现K值相近的物质的分离。
4、凝胶层析时,要保持胶面平整,并且不能干柱,简述其原因。
答：对于凝胶层析，在加样的时候要保持胶面平整，因为如果胶面不平，那么所加入的样品将先从低凹处渗入，而在其他位置的样品由于渗透阻力的影响，也会在横断面上向低凹点方向迁移。从而造成在柱横断面上的样品分布不均匀，从侧面观察，就体现在样品带变宽；从洗脱结果看，将造成洗脱峰变宽，影响分离效果。如果干柱的话，样品溶液首先充满干柱部分，也会造成洗脱峰的严整变宽甚至无法洗脱分离，使整个实验失败。
5、凝胶层析时为什么要在洗脱液中加入一定量的盐离子并保持一定的pH值。
答：凝胶层析时在洗脱液中加入一定量的盐离子并保持一定的pH值主要是为了防止凝胶和待分离组分之间的吸附作用，以期达到完全按凝胶排阻效应进行分离的目的。
6、为何洗脱Vt体积的洗脱液即可将全部样品洗出（吸附的样品除外），能否用Kav的公式说明之。
答：在凝胶层析中，对物质的分离是通过排阻效应实现的，分离的尺度是分离对象分子的大小，大分子先流出，小分子后流出。所以只要能把小分子洗脱出来，即已把全部样品洗出。对于完全渗透的小分子，因为它可以存在于凝胶柱的整个体积内（凝胶本身的体积很小），所以只要洗脱液充满整个空间，则通过两相分配，就能洗脱出来，即洗脱体积为柱床体积Vt。从另一角度Kav的公式也能说明：Kav=（Ve–V0）/（Vt–V0）。对于没有吸附的样品，0≤Kav≤1，所以从公式可以看出，V0≤Ve≤Vt，即洗脱体积最大达到Vt时即能把全部样品洗出。
八、参考文献
余冰宾，周广业，段明星，陈坚刚，马红编. 生物化学实验方法技术. 清华大学, 2001
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