年产1000吨苏云金芽孢杆菌的发酵车间工艺设计
第1章 绪论
1.1项目背景
我国研究和应用苏云金杆菌起于1959年，于1965年在长沙和武汉进行了工业化生产，也就是工业生产初级阶段，到70年代工业产品每年1000t左右，1974年湖北宜昌地区，飞机防治松毛虫的面积达82.5万亩，取得了满意的效果。1990年，我国苏云金制剂[1]的产量超过1500t，1994年，我国大田使用Bt杀虫剂达一万多吨，为1984年的100倍，在工业生产规模上得到了空前的发展。
我国在1995年国家高技术发展计划中，把构建一批杀虫Bt的工程菌列入了农业重组微生物重点项目，中国农业科学院植保所，华中农业大学以及中山大学等均进行了构建Bt工程菌的尝试，并取得了显著的成果。
发酵技术日趋成熟。以液体深层发酵为代表的发酵技术应用于工业生产中，发酵水平及吨位逐步提高，由60年代的几百升，70年代的几吨，发展到目前的50吨以上。随着离心喷雾，气流粉碎等技术生产工艺应用，代替了原来的压滤浓缩，烘干及粉碎等生产工艺，从而使剂型改变了过去以粉剂为主的状况，油剂，片剂，微囊剂等剂型的出现，使Bt的施用更具有针对性
1.2苏云金芽孢杆菌介绍
1.2.1苏云金芽孢杆菌定义
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)于1901年在日本被发现，1911 年由柏林纳从地中海粉螟的患病幼虫中分离出来，并依其发现地点德国苏云金省而命名. 苏云金芽孢杆菌简称苏云金杆菌，是内生芽孢的革兰氏阳性土壤细菌，在芽孢形成初期会形成杀虫晶体[2]蛋白(insecticidal crystal protein)，对敏感昆虫有特异性的防治作用. 1956 年前苏联发表了用液体培养基摇瓶培养苏云金杆菌并用于防治菜青虫的报道，从而揭开了苏云金杆菌大规模培养的序幕. 中国从上世纪60 年代也同苏云金杆菌有关的研究，特别是有关分子生物学方面的研究正在持续展开，开始了规模化生产. 但在发酵工艺方面还需进一步加强. 随着人们的环保意识不断增强，生物农药正在引起越来越多
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的关注. 苏云金杆菌制剂克服了传统化学农药污染环境、危害人畜、易产生抗性等缺点，具有选择性强、安全、原料简单等优点，在生物杀虫剂市场中所占份额也日益增加。
1.2.2苏云金芽孢杆菌资源
全世界被保藏的 Bt估计有 60 000株 ,它广泛分布于世界各地 ,从热带雨林到北极冻土带。已经从许多材料上分离获得该菌 ,如土壤、植物叶片、鲜水 、粪便 、动物活体 、食物、仓储等 ,可见几乎无处不在。土壤是微生物的大本营 ,Bt也是一种土壤习居菌。Martin和 Travers从土壤中找到新的 Bt菌种 ,这一事实改变了 Bt菌的历史。因为起初科学家们认为 ,只有找到死昆虫才能找到这些细菌。本来以为它是一种昆虫病 ,但实践证明 ,Bt实际上是多种土壤中的正常组份。Martin和 Travels发明的新技术 ,仅花了 2年时间又鉴定出 72个菌种 ,而大家熟知的 24个菌种却花了 85年时间才被发现事实上 ,在海拔近 6. 5 km的高处几乎没有昆虫生存 ,而在那里科学家仍发现了能杀死毛虫、蚊子和甲虫的 Bt菌种。因此 ,“不管是取自喜马拉雅山的土壤 ,或汽车轮胎上的冰岛土壤 ,甚至猫脚底下的土壤 ,都可能使某种害虫致死 ”。在世界范围内 ,平均有 70. 4%的 Bt菌株来自土壤 ,其中美国土壤分离株占总菌株的 59. 9%,Delucca等 1981 发现美国土壤样本中芽孢杆菌的 0. 5% ～0. 005%是Bt。欧洲占 83. 9%,新西兰占 55. 6%,东亚占94. 3%,日本占 36. 8%, 韩国占 51%, 越南占64. 3%。我国也有多家单位进行 Bt资源的收集如中国林业科学院的戴莲韵、王学聘等 ,华中农业大学喻子牛、戴金元、李建洪 ,湖北农业科学院杨自文、陈在佴 ,中国科学院武汉病毒所李荣森、高梅影等 ,南开大学任改新、陈月华等 ,河北农业科学院冯书亮 ,连云港教育学院姚江 ,中国农业科学院黄大等 ,中山大学庞义 ,福建农林大学关雄、张灵玲等 ,获得了许多 Bt菌株 ,如华中亚种 ,山东亚种 ,中华亚种 ,云南亚种等 ,但至今还没有详细地统计出具体数据。20世纪 90年代起 ,人们把寻找 Bt的目光转到植物上。1991年 Smith和 Couche从不同针叶树和落叶树叶片分离到 Bt菌株 ,人们发现 Bt实际上也广泛存在于植物叶片 , 1996年 Ohba从 25棵桑树 1 004片桑叶中分离出 186个 Bt菌落 ,其中棵桑树 96% , 112片桑叶 11. 2% 均分离到Bt ;Damgaard 等从卷心菜叶、
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牧草和与卷心菜有关的昆虫上均分离获得 Bt;Normander 等第一次进行了豌豆叶面细菌的分布; Rizali等 从印尼桑叶上分离了 2株 Bt菌株;Mizuki等 从日本35种木本和草本植物分离出 120株 Bt菌株; Kaelin和 Gadani 用 2年的时间 1996—1997年 调查了 18个国家 Bt在卷烟叶上的出现频率和分布情况;Maduell等 从哥伦比亚安第斯山脉海拔1 800～2 500 m之间 3个高度采集胡椒科属 13个种的 35个叶片样本中分离出 266株 Bt,并进行了菌株伴孢晶体形态学的研究;张灵玲等 也从 2个科植物叶片中分离到 54株 Bt菌株 ,还首次从苔藓上分离获得杀虫新菌株。
1.2.3苏云金芽孢杆菌鉴定与分类
Bt属芽孢菌 ,能产生晶体是它区别于其他芽孢杆菌的标志。Bt传统分类与其他芽孢杆菌一样也是根据细胞学、培养特性、生化反应以及遗传学特性。血清学分类是该菌长期应用的一个最实用的指标 ,目前有 70个血清型和 84个亚种 ,所有血清亚种均可从法国巴黎的巴斯德研究所索取获得但其存在的缺点是无法反映致病性和寄主范围 ,因而还是有一定的局限性。20世纪 90年代后 , PC等分子生物学的方法和技术广泛用于该菌的基因鉴定 。Bc类生物除自身外 ,还包括昆虫病原菌 Bt,人类病原菌炭疽芽孢杆菌 Bacillus anthracis, Ba 以(及假根状的覃状芽孢杆菌 Bacillus mycoides,)Bm。近来，B. pseudomycoides 和 B. weihens2tephanensis也收入其中。表型特征和有机物利用都无法区别 Bt和 Bc,如细胞脂肪酸含量、糖含量、多位点酶电泳、肠毒素[3]、噬菌体定型技术。DNA同源分析如核糖体、16SrDNA序列、16S223S转录间隔区序列、基于 Bc毒素产物的 PCR和脉冲胶都无法区别 Bt和 Bc。1992年 Brousseau等用随机扩增指纹技术区别 Bt和 Bc, 1997年 Giffel等只发现少量 Bt和 Bc的 16SrDNA序列有差异 ,1998年 Beat2tie等采用傅里叶变换红外光谱技术区分 Bc种类 ,总之 ,Bt和 Bc是很难区分的 。随着 2004年 4月美国 Bt全序列的公布 ,通过染色体结构比较基因组学和功能基因组学的研究 ,一定能更清楚地了解 Bt和 Bc的功能和区别。
1.2.4苏云锦芽孢杆菌生态学及安全性
Bt在自然界中的作用和循环至今不是很清楚。有些假设认为它是植物共生或互利以
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保护植物不受食草动物的危害。有些植物化学物质能钝化 Bt,Luthy证明棉花叶片的提取液会使 ICP失效。在 20℃情况下 ,Btk可在鲜水中存活 70 d,在海水中存活 40 d。它在湖水中存活时间比自来水长得多 ,因为前者富含营养。
国内外大量试验表明 ,一般应用 Bt还是安全的。但是有点必须给予关注。一是有些菌株含β有 -外毒素 ,它对哺乳动物等有毒 ,欧美国家禁β止使用。有些国家采用含 -外毒素的 Bt产品防治家蝇 ,但许多机构则禁止使用。第二个问题也是争论比较多的是 Bt如何与 Bc分清楚。因为后者会导致人的呕吐和腹泻。二者都含有肠毒素基因 ,只不过根据研究 ,Bt的基因表达量很低而已。丹麦市场的 50%生物农药是 Bt产品。2005年 ,丹麦学者 Rosenquist等从零售商场 48 901份样本中发现有 0. 5%的样本含有 Bc类细菌,总量达 10 cfu/以上。含淀粉及熟食类样品最多 ,新鲜黄瓜和番茄亦有发现。随机选择 40个菌株 ,发现至少包括一种致腹泻的基因或成分 ,而只在 1株 Bc中发现催吐毒素。而在随机选择的 40个 Bc类菌株中 ,有31株是 Bt。因此 ,食品中大量的 Bc类细菌可能应属 Bt 。国际化学联合会 IUPAC 颁布了 Bt发酵产品的国际标准 Quinlan, 1990 。它包括了产品中其他微生物及其代谢产物的污染。各种微生物及其最大浓度的量是:嗜温性微生物 <1 ×10 CFU/g ,酵母 和 霉 菌 < 100 CFU/g , 大 肠 杆 菌 类5<10 CFU/g ,金黄色葡萄球菌 <1 CFU/g ,沙门氏菌 <1 CFU/10g ,兰斯斐尔德氏链球菌 D组<1 ×10 CFU/g 。
1.2.5苏云金芽孢杆菌产品化
国内外至少有 100多种 Bt产品 ,在世界范围内防治农业、林业和卫生等害虫广泛应用 ,Bt制剂占微生物4农药的 90%以上。Bt生产主要是液体深层发酵。生产工艺主要牵涉到菌种，培养基和培养条件 ,后处理工艺、防止噬菌体污染等几方面。许多科学家尝试进行菌种选育和改良 ,经过国内外 10多年的努力 ,尽管我们利用分子生物学技术构建了大量的工程菌 ,但除国外的 Ciba2Geigy等少数公司外 ,工程菌还没有大规模的应用于生产。噬菌体污染长期是 Bt生产的一大威胁 ,我国科学家和企业紧密配合 ,如湖北农业科学院、福建浦城绿安公司等先进的 Bt企业在实践中摸索了一系列控制技术 ,
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有效地控制了因噬菌体而引起的“倒罐 ”。采用先进的后处理工艺是大幅度提高 Bt产品效价的根本性措施。我国 20世
纪 50—80年代所采用的“板框压滤 ”技术 ,只能生产出低效价的产品 ,后来采用“连续离心 ”,改变了工艺 ,提高了效价 ,当今借鉴医药生产所使用的“超滤浓缩”和喷雾干燥 ,使得 Bt产品得到突飞猛进的效果。有关剂型 ,国外比国内要丰富得多 ,包括可湿性粉济、悬浮剂、水分散颗粒剂、油悬剂、胶囊剂和颗粒剂 ,而国内主要是悬浮剂和可湿性粉剂。我国由于长期依赖于低成本的劳动力 ,再加上我们习惯于消费低质量低价格的农产品如蔬菜等 ,造成了只注重数量不注重质量的习惯 ,随着人们生活水平的不断提高和对食品安全的关注 ,相信一定会在生物农药工业做更大的投入 ,将生产出更多高质量的Bt产品。
1.3设计方案
1.3.1产品方案 产量的确定
产量5的大小直接影响到设备的配套、车间的布置和面积、公用设施和辅助设施的大小，以及劳动力的定员等。班产量主要由原料供用量的多少、生产季节的长短、延长生产期的条件（如冷库及半成品加工措施等）、定型作业线或主要设备的生产能力、每天生产班次及产品品种的搭配以及厂房、公用设施的综合能力等因素制约。另外，班产量的确定还与市场销售能力有关系。
生产班制
苏云菌芽孢杆菌生产企业每天生产班次为1～2班。根据加工品的市场需求，酸乳厂生产工艺特点，原料特性及加工设备的生产能力和运转状况，一般淡季一班，中季二班，旺季三班。
生产天数及日产量
酸乳厂由于受到市场需要、季节气候、生产条件（温度、湿度等）和原料供应等方面影响，生产天数和生产周期大不相同。酸乳生产旺季在夏季6月、7月、8月，旺季
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