40％KOH；肌酐（Creatine）蛋白胨琼脂；氯化钠胆盐；葡萄糖；KH2PO4 ；0.2％酚红；0.2％溴麝香草酚蓝；纯乙醇；浓盐酸；１０％硫代硫酸钠；１０％醋酸铅
微量糖发酵管（上海化学试剂二厂）分别为：蔗糖；山梨醇；棉实糖；葡萄糖；甘露糖；蕈糖；乳糖；菊糖；水杨苷；马尿酸钠
药敏纸片（上海伊华医学科技有限公司生产）分别为：
头孢菌素；庆大霉素；洁霉素；青霉素；卡那霉素；链霉素；土霉素；复方新诺明；万古霉素；红霉素；利福平；氯霉素；恩诺沙星；痢特灵
猪链球菌诊断血清与平板凝集抗原（中国兽药鉴察所） 1.1.4 培养基的制备
兔鲜血平板：将灭菌的营养琼脂加热融化，冷至45～50℃时，加入无菌鲜血达5%（即每100毫升营养琼脂中加入鲜血5～6毫升）倾注于平皿，待凝固后，置37℃培养1～2日，有污染者废弃，无菌者保存于冰箱备用。
牛血清肉汤：向灭菌的营养肉汤中加入牛血清，每100毫升加20毫升牛血清，分装试管，置37℃培养1～2日，有污染者废弃，无菌者保存于冰箱备用。
麦康凯培养基：取成品50克加入1000毫升冷蒸馏水，混合放置20分钟，隔石棉铁丝网微火煮沸至全部溶解，高压灭菌（115℃）15分钟后冷却至50℃左右，倾入无菌平皿内，凝固后冷藏备用。
营养琼脂： 取成品41克加入1000毫升冷蒸馏水混合放置20分钟，隔石棉铁丝网微火煮沸，至全部溶解，分装入适当容器中高压灭菌（121℃）15分钟，凝固后冷藏备用。
Christenrsen氏培养基：1升含蛋白胨1克，葡萄糖1克，氯化钠5克，KH2PO4 2克0.2％酚红溶液6ml，琼脂20克，调整pH至6.9。在121℃高压灭菌15分钟，使冷到55℃时加入十分之一的20％尿素液（经滤过法除菌的）使尿素含量为2％（即每1000ml中有20克），做成短斜面。
邓亨氏蛋白胨溶液：蛋白胨水溶液（蛋白胨1克，氯化钠0.5克，水100ml,pH7.6）按0.5％～1％的比例加入葡萄糖（或其他各种糖），每100ml加入1.2ml的0.2%溴麝香草酚蓝（或用1.6％溴甲酚紫酒精溶液0.1ml）作指示剂。分装于试管（每一个试管事先加有一枚倒立的小发酵管），10磅高压灭菌10分钟。
甲基红试验培养基：含葡萄糖、K2HPO4、蛋白胨各5克，完全溶解于1000ml水中后，分装试管内，间歇灭菌或10磅10分钟灭菌。
欧立希氏吲哚试剂： 对位二甲基苯甲醛1克，纯乙醇95ml，浓盐酸25ml,
[21]
先以乙醇溶液试剂后加盐酸，要避光保存。 1.1.5 试验动物
健康小白鼠（30～35g）10只，购自沈阳医科大学实验动物中心。
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1.2 试验方法
1.2.1 染色镜检
将所采病料分别涂片，用革兰氏染色镜检抹片的制备及染色：先用灭菌接种环取少量生理盐水或蒸馏水，置于玻片中央，然后再用灭菌接种环取少量菌落在液滴中混合，均匀涂布成适当大小的薄层。让其然干燥。固定用火焰固定法。将干燥好的抹片使涂面向上，以其背面在洒精灯火焰上来回通过数次，略作加热（但不能太热，以不烫手为度）进行固定。染色用革兰氏染色法。
革兰氏染色法： （1） 在已干燥、固定好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫染色液，经1-2分钟，
水洗。
（2） 加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-3分钟，水洗。 （3） 加95%酒精于抹片上脱色，约30秒至1分钟，水洗。
（4） 加稀释石炭酸复红（或沙黄水溶液）复染10-30秒钟，水洗。 （5） 吸干或自然干燥，镜检。革兰氏阳性菌呈蓝色，革兰氏阴性菌呈红色。 1.2.2 细菌分离培养
将所采病料，分别接种鲜血琼脂平板，麦康凯平板，营养琼脂平板。37℃需氧培养24h后，挑取可疑菌落接种于改良马丁肉汤，37℃培养24h后，革兰氏染色，显微镜检查，再接种血清肉汤，纯化后放置4℃，冷藏备用。 1.2.3生化试验
随机抽取上述分离菌血清肉汤培养物3#、8#、13#、15#，分别作以下生化试验。
糖发酵试验：用灭菌接种针将待检菌分别接种于微量糖发酵管中（分别为蔗糖 山梨醇 棉实糖 葡萄糖 甘露糖 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨苷 马尿酸钠），然后将其倒置于烧杯中，在恒温箱中37℃培养，24小后观察。凡发酵管中有变色者表示此菌产酸，凡培养基变色并产气者为此糖产酸产气，凡培养基不变色者表示该菌不发酵此糖。
维培（V-P）二氏试验：
原理：某些细菌能从葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇（Acetyethyl carbinol）→2，3-丁烯二醇（2，3-bytaylene cylycol）,在有碱存在时氧化成二乙酰，后者和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。
方法：（O′Mearaa′s试剂法） 40％KOH 5ml、肌酐1小刀尖加入于5ml（即与培养基等量）的培养物中，猛烈摇振混合。37℃培养24～48小时，加数滴试剂，略加摇匀半分钟，待试剂上浮液面，试剂呈红色为阳性反应。
硫化氢产生试验：
方法：用接种针将待试菌穿刺接种于醋酸铅培养基或硫酸亚铁培养基
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中。37℃卵育1～4天，每天检查，沿穿刺线或其周围变为黑色为阳性反应。
甲基红（M.R）试验：
方法：接种细菌于培养液中，在37℃培养2～7天后。于培养物中加入
几滴试剂，变红者为阳性反应，（从葡萄糖产酸，培养液的pH低于4.2）。
吲哚（靛基质）试验：
原理：细菌能分解蛋白质中的色氨酸生成吲哚，后者与对位二甲基氨基
苯甲醛作用，形成玫瑰吲哚而呈红色。
方法：以接种环接种待检细菌的新鲜斜面培养物于邓亨氏蛋白胨溶液
中，在37℃培养24～48小时（可延长4～5天）。于培养液中加入戊醇或二甲苯2～3ml,摇匀，静置片刻后，沿试管壁加入试剂2ml。在戊醇或甲苯下面的液体变红色者为阳性反应。
枸橼酸盐利用试验：
方法：用灭菌的接种针蘸取待检液，在枸橼酸盐培养基的斜面上划线接
种，再穿刺接种。在37℃培养2～3天，观察培养基上是否有细菌生长，并观察颜色变化。如果有细菌生长，并且颜色变为天蓝色，则为阳性反应，说明此菌能利用枸橼酸盐。
硫化氢试验：
原理：细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢（H2S）者，其所产生的H2S
会使培养基中的醋酸铅或FeCl3形成黑色的硫化氢或硫化铁。
方法：在融化的琼脂内加入硫代硫酸钠溶液（先煮沸灭菌），待凉至
60℃，再加入醋酸铅溶液，混合均匀，无菌分装灭菌试管达三指高，立即浸入冷水中，使冷凝成琼脂高层。用接种针蘸取纯培养物，沿试管壁作穿刺，孵育于37℃经１～２天后观察，必要可延长５～７天。培养基变为黑者为阳性[6]。
1.2.4血清学鉴定
将3#、8#、13#、15#菌经缓冲肉汤培养8h，通过3000r/min离心10min，PBS洗涤2次，用pH7.2 的0.01mol/L PBS制成1/10000～1/20000细菌悬液[11]。取1滴上述细菌悬液与适当的抗血清在洁净玻片上混匀，立即观察凝集现象。同时，设立细菌悬液对照及血清对照。 1.2.5动物致病性试验
小白鼠感染实验：用5只20克左右重的小白鼠腹腔接种分离菌血清肉汤培养物0.2毫升，另设5只分别腹腔注射0.2毫升血清肉汤作对照。对注射后的小白鼠隔离饲养，观察其发病及死亡情况，对死亡的小白鼠立即解剖，无菌采取肝脏，脾脏病料，涂片，革兰氏染色，镜检。并在鲜血琼脂平板上
[12]
划线分离培养。 1.2.6药敏试验
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采用纸片扩散法，用无菌棉签蘸取分离菌的血清肉汤培养物，均匀涂布于9cm鲜血平板；待稍干后，用无菌镊子将各种药敏纸片分别平贴在培养基表面，4℃2h使药物扩散，然后置37℃培养20～24h，观察结果。结果按抑菌圈直径大小和各抗菌药的具体标准，评定为高度敏感、中度敏感或耐药[13]。结果评定参照表1。
表 1 各种抗菌药物的抑菌圈与敏感标准
抗菌药物名称
青霉素 土霉素 洁霉素 链霉素 庆大霉素 卡那霉素 头孢菌素 万古霉素 红霉素 利福平 呋喃妥因 氟哌酸 复合磺胺 氯霉素
抑菌圈直径（mm） 耐药 <10 <10 <10 <10 <12 <12 <10 <10 <14 <16 <15 <13 <11 <13
中度敏感 10～12 10～14 10～14 10～14 13～14 13～14 10～15 10～11
14～22 16～20 15～17
13～17 11～16 13～18
高度敏感 >13 >15 >15 >15 >15 >15 >15 >12 >22 >20 >17 >17 >16 >18
2 结果与分析
2.1涂片、染色、镜检结果
关节液、鲜血琼脂、改良马丁肉汤及血清肉汤培养物涂片、革兰氏染色、显微镜检查为革兰氏阳性，在关节液、鲜血琼脂培养物中多呈单个、双球或短链状排列，在改良马丁肉汤及血清肉汤培养物中多呈长链状。
2.2分离培养结果
37℃培养24h后，所采的16份病料在鲜血琼脂平板上形成表面光滑、隆起的灰绿色小菌落，外层有明显的β溶血环。在麦康凯琼脂平板上不生长。在营养琼脂上生长不好。该菌在改良马丁肉汤中底部有沉淀，在血清肉汤中
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先均匀浑浊，后在试管底部形成沉淀，上部澄清，不形成菌膜。
2.3生化试验结果（见表2、表3）
表2 糖发酵试验结果
菌号 项 目
蔗糖 山梨醇 棉实糖 葡萄糖 甘露糖 蕈糖 乳糖 菊糖 水杨苷 马尿酸钠
3# + - - + + + + + + - 8# + - - + + + + + + - 13# + - - + + + + + + - 15# + - - + + + + + + -
表3 其它生化试验结果
项目 菌 号
3# 8# 13# 15#
维培（V-P）二氏试验 - - - - 靛基质（吲哚）试验 - - - - 甲基红（M.R）试验 - - - - 枸橼酸盐利用试验 - - - - 硫化氢试验 - - - -
判定标准：“+”表示大多数（90%～100%）菌株为阳性；“-”表示大多数（90%～100%）菌株为阴性。
表2表明分离的3#、8#、13#、15#菌的生化反应结果均符合猪链球菌的生化特性，说明分离的菌均为猪链球菌。
2.4 血清学鉴定结果
将3#、8#、13#、15#细菌悬液与1/2及2型抗血清混合，立即可见明显的凝集现象，但不与1型及其他型抗血清出现凝集。直接挑取细菌菌落与血清混匀，也能得到一致结果。阴性对照均未见凝集现象。
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