《生物选修1：生物技术实践 教师教学用书》
答：平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后的培养基表面的湿度也比较高，将平板倒置，既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防止皿盖上的水珠落入培养基，
造成污染。
4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生物吗？为什么？ 答：空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养微生物。 （三）平板划线操作的讨论
1.为什么在操作的第一步以及每次划线之前都要灼烧接种环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环吗？为什么？
答：操作的第一步灼烧接种环是为了避免接种环上可能存在的微生物污染培养物；每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束后，接种环上残留的菌种，使下一次划线
时，接种环上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以便得到菌落。划线结束后灼烧接种环，能及时杀死接种环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。
2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再进行划线？ 答：以免接种环温度太高，杀死菌种。
3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么总是从上一次划线的末端开始划线？
答：划线后，线条末端细菌的数目比线条起始处要少，每次从上一次划线的末端开始，能使细菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的
菌落。
（四）涂布平板操作的讨论
涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想一想，第2步应如何进行无菌操作？
提示：应从操作的各个细节保证“无菌”。例如，酒精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触任何其他物体、吸管要在酒精灯火焰周围；等等。 （五）练习
1.提示：可以从微生物生长需要哪些条件的角度来思考。例如，微生物的生长需要水、空气、适宜的温度，食品保存可以通过保持干燥、真空的条件，以及冷藏等方法来阻
止微生物的生长。
2.提示：可以从这三种培养技术的原理、操作步骤等方面分别进行总结归纳。例如，这三种培养技术都需要为培养物提供充足的营养，但无土栽培技术的操作并不需要保证
无菌的条件，而其他两种技术都要求严格的无菌条件。
3.提示：这是一道开放性的问题，答案并不惟一，重点在于鼓励学生积极参与，从不同的角度思考问题。例如，正是由于证明了微生物不是自发产生的，微生物学才可能发
展成为一门独立的学科；巴斯德实验中用到的加热灭菌的方法导致了有效的灭菌方法的出现，而这一灭菌原理也适用于食品的保存等。 2005-03-31
课题2 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数
一、课题目标
研究培养基对微生物的选择作用，进行微生物数量的测定。 二、课题重点与难点
课题重点：对土样的选取和选择培养基的配制。 课题难点：对分解尿素的细菌的计数。 三、课题背景分析
教材从尿素在农业上的重要用途切入，介绍了土壤中能分解尿素的细菌，进而说明这种细菌的作用是能够合成分解尿素的酶。教学中，教师可以联系生产生活实际，使学生
对尿素以及分解尿素的细菌形成一定的感性认识。教材还简要地介绍了尿素的发现过程以及尿素合成的历史，这些都是“科学、技术、社会”教育的丰富素材。最后，教材明确指出了本课题的目的，有助于学生准确把握课题的方向。
四、研究思路 （一）筛选菌株
微生物的选择培养，是指利用培养基的组成使适宜生长的特定微生物得到较快繁殖的技术，也称为微生物的“选择培养”。在本课题提供的选择培养基的配方中，尿素是培
养基中的惟一氮源，因此，原则上只有能够利用尿素的微生物才能够生长。但实际上，微生物的培养是一个非常复杂的问题，有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物生长繁殖，因此能够在选择培养基上生长的微生物不一定是所需要的微生物，还需要进一步的验证。
（二）统计菌落数目
统计菌落数目的理论依据是：当样品的稀释度足够高时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中的一个活菌。因此，恰当的稀释度是成功地统计菌落数目的关键。
为了保证结果准确，通常将几个稀释度下的菌液都涂布在平板上，培养后再选择菌落数在30～300的平板进行计数。
教材中用楷体字编排的实例是为了说明设置重复组的重要性。第一位同学只涂布了一个平板，没有设置重复组，因此结果不具有说服力。第二位同学考虑到设置重复组的问
题，涂布了3个平板，但是，其中1个平板的计数结果与另2个相差太远，说明在操作过程中可能出现了错误，因此，不能简单地将3个平板的计数值用来求平均值。这个实例启
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示学生，在设计实验时，一定要涂布至少3个平板，作为重复组，才能增强实验的说服力与准确性。在分析实验结果时，一定要考虑所设置的重复组的结果是否一致，结果不一致，意味着操作有误，需要重新实验。
（三）设置对照
A同学的结果与其他同学不同，可能的解释有两种。一是由于土样不同，二是由于培养基污染或操作失误。究竟是哪个原因，可以通过实验来证明。实验方案有两种。一种
方案是可以由其他同学用与A同学一样的土样进行实验，如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。另一种方案是将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。
五、实验案例
土壤中某样品细菌的分离与计数 实验的具体操作步骤如下。
1.土壤取样 从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3 cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。
2.制备培养基 准备牛肉膏蛋白胨培养基和选择培养基将菌液稀释相同的倍数，在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的菌落数目应明显多于选择培养基上的数目，因此，牛肉膏蛋
白胨培养基可以作为对照，用来判断选择培养基是否起到了选择作用。由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为10～10。每个稀释度下需要3个选择培养基，1个牛肉膏蛋白胨培养基，因此共需要15个选择培养基，5个牛肉膏蛋白胨培养基。此外，还需要准备8个灭菌的试管和1个灭菌的移液管。
3.微生物的培养与观察 参考课本中图2-7的实验流程示意图，将10 g土样加入盛有90 mL无菌生理盐水的锥形瓶中（锥形瓶体积为250 mL），充分摇匀，吸取上清液1 mL，
转移至盛有9 mL的生理盐水的无菌大试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由10～10稀释度的顺序分别吸取0.1 mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。
将涂布好的培养皿放在30 ℃温度下培养。随着培养时间的延长，会有不同的菌落产生。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基的斜面中，观察能否产生如课本中图2-10的颜色反应。
4.细菌的计数 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30～300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释
度计算出样品中细菌的数目。
六、课题成果评价
（一）培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出菌落
对照的培养皿在培养过程中没有菌落生长，说明培养基没有被杂菌污染。牛肉膏培养基的菌落数目明显大于选择培养基的数目，说明选择培养基已筛选出一些菌落。 （二）样品的稀释操作是否成功
如果得到了2个或2个以上菌落数目在30～300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数。 （三）重复组的结果是否一致
如果学生选取的是同一种土样，统计的结果应该接近。如果结果相差太远，教师需要引导学生一起分析产生差异的原因。 七、答案和提示 （一）旁栏思考题
1.想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？
答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。
2.为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？
答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数
约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。
（二）练习
2.提示：反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除
了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。 2005-03-31
课题3 分解纤维素的微生物的分离
一、课题目标
简述纤维素酶的种类及作用，从土壤中分离出分解纤维素的微生物，讨论这类微生物的应用价值。 二、课题重点与难点
课题重点：从土壤中分离分解纤维素的微生物。 课题难点：从土壤中分离分解纤维素的微生物。 三、课题背景分析
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教材首先说明了纤维素的化学组成以及纤维素在生物圈的广泛分布，由此转入到如何对纤维素进行有效利用的问题。接着，教材介绍了产纤维素酶的微生物能够分解纤维素，
因此，对纤维素的利用离不开对分解纤维素的微生物的研究。最后，教材点明了本课题的研究主题，即从土壤中分离能够分解纤维素的微生物。
四、基础知识分析与教学建议 （一） 纤维素与纤维素酶
知识要点： 1.纤维素在生物圈的分布；2.纤维素酶的作用。
教学建议：有关纤维素的知识，教师可以联系必修模块《分子与细胞》中多糖的知识并安排学生通过阅读进行自学，学生自学后应该能够说出纤维素的化学组成以及在生物
圈中的分布状况。关于纤维素酶的作用，教师可以参照课本的楷体字部分做演示实验。该实验的现象明显，能使学生对纤维素酶的作用留下深刻的印象。如果不做实验，也可以参照课本中图2-12来了解纤维素酶的作用。
（二）纤维素分解菌的筛选
知识要点： 1.刚果红染色法；2.刚果红染色法的原理。
教学建议：教材在介绍刚果红染色法之前，首先用“筛子筛沙”这一形象的比喻来说明筛选微生物的基本思想方法。教师还可以结合本专题课题2介绍选择培养基的有关内
容，进一步引导学生深入认识分离微生物的基本思想。刚果红染色法的知识难度并不大，学生通过自学就能够理解。
五、实验案例
土壤中纤维素分解菌的分离 实验的具体操作步骤如下。
1.土样采集 土样采集的方法与本专题课题2类似。土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。如
果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，过一个月左右也会有能分解纤维素的微生物生长。
2.选择培养 选择培养需要的仪器有：250 mL锥形瓶、无菌称量瓶、药匙、1 mL和10 mL的移液管、天平、摇床、温度计等。
培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在250 mL锥形瓶中装入30 mL培养基，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层包装纸（或报纸），用线绳扎
紧，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。
选择培养的操作：称取土样20 g，在无菌条件下加入装有30 mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30 ℃下振荡培养1～2 d，至培养基变混浊。此时可以吸取0.1 mL
培养液进行梯度稀释和涂布平板，也可以按课本中所述，重复选择培养的步骤一次，然后再进行梯度稀释和涂布平板。
3.刚果红染色法分离 纤维素分解菌这一步所需要的仪器有：无菌培养皿、涂布器、1 mL移液管，装有9mL无菌水的20 mL大试管，温箱等。 培养基的制备参照课本旁栏中的比例配制。在500 mL三角瓶中装入200 mL培养基，在121 ℃下高压蒸汽灭菌20 min。 倒平板操作：将灭菌后的固体培养基熔化，按无菌操作的要求，在无菌的培养皿中倒入15～20 mL培养基，凝固后待用。 制备菌悬液：按照本专题课题1的稀释操作方法，将选择培养后的培养基进行等比稀释，稀释最大倍数至10。
涂布平板：将稀释度为104～106的菌悬液各取0.1 mL，滴加在平板培养基上，用涂布器将菌液涂布均匀，在30 ℃倒置培养，至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板，
并注意设置对照。刚果红染色的具体操作步骤参照课本［资料三］。
六、课题成果评价
（一）培养基的制作是否合格以及选择培养基是否筛选出菌落：对照的培养基在培养过程中没有菌落生长则说明培养基制作合格。如果观察到产生透明圈的菌落，则说明可
能获得了分解纤维素的微生物。
（二）分离的结果是否一致：由于在土壤中细菌的数量远远高于真菌和放线菌的数量，因此最容易分离得到的是细菌。但由于所取土样的环境不同，学生也可能得到真菌和
放线菌等不同的分离结果。
七、答案和提示 （一）旁栏思考题
1.本实验的流程与课题2中的实验流程有哪些异同？
答：本实验流程与课题2的流程的区别如下。课题2是将土样制成的菌悬液直接涂布在以尿素为惟一氮源的选择性培养基上，直接分离得到菌落。本课题通过选择培养，使
纤维素分解菌得到增殖后，再将菌液涂布在选择培养基上。其他步骤基本一致。
2.为什么要在富含纤维素的环境中寻找纤维素分解菌？
答：由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。 3.将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋进土壤多深？
答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对聚集，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将纸埋于深约10 cm左右腐殖土壤中。 4.想一想，这两种方法各有哪些优点与不足？你打算选用哪一种方法？ 提示：参看本课题参考资料的内容。
5.为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？
答：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速繁殖，而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“浓缩”的作用。
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《生物选修1：生物技术实践 教师教学用书》
（二）练习
2.答：流程图表示如下。
土壤取样→选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）→梯度稀释→将菌悬液涂布到有特定选择作用的培养基上→挑选单菌落→发酵培养 八、参考资料 1.纤维素与纤维素酶
纤维素与淀粉都是由葡萄糖组成的，但组成两者的葡萄糖的连接方式不同，因而使两者的形态完全不同。纤维素是由葡萄糖分子按β-1,4糖苷键连接而成的，淀粉是由葡
萄糖分子按α-1,4糖苷键连接而成的。
人类以淀粉为主要能量来源，但完全不能消化纤维素，而反刍动物和大量的微生物则主要以纤维素为能量来源。这是因为，在反刍动物的瘤胃中生活着大量的可以分解纤维
素的微生物。微生物产生的纤维素酶是一种复合酶，包括内切酶（Cx酶）、外切酶（C1酶）和葡萄糖苷酶。内切酶作用于无定型的纤维素区域，使纤维素断裂成片段；外切酶又叫纤维二糖水解酶，它可以作用于纤维素的结晶区或小片段纤维素，从糖链末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖；葡萄糖苷酶则将纤维二糖分解成葡萄糖。
2.两种刚果红染色法的比较
刚果红在筛选纤维素分解菌上的应用已经有超过20年的历史，在本课题中我们给出了两种方法。方法一是传统的方法，缺点是操作繁琐，加入刚果红溶液会使菌落之间发
生混杂；其优点是这样显示出的颜色反应基本上是纤维素分解菌的作用。方法二的优点是操作简便，不存在菌落混杂问题，缺点是由于纤维素和琼脂、土豆汁中都含有淀粉类物质，可以使能够产生淀粉酶的微生物出现假阳性反应。但这种只产生淀粉酶的微生物产生的透明圈较为模糊，因为培养基中纤维素占主要地位，因此可以与纤维素酶产生的透明圈相区分。方法二的另一缺点是：有些微生物具有降解色素的能力，它们在长时间培养过程中会降解刚果红形成明显的透明圈，与纤维素分解菌不易区分。 2005-03-31
专题3 植物的组织培养技术
植物组织培养技术应用广泛。利用植物组织培养技术，可以实现优良品种的快速繁殖，培养出大量不含病毒的幼苗，实现花卉的连续生产，缩短育种周期等。本专题是在必
修课基础上，引导学生尝试植物的组织培养，使学生初步掌握植物组织培养的基本技术。
专题分析
一、 教学目的要求
本专题的两个课题均依照课程标准制定的具体内容标准编排，其对应关系如下表。
具体内容标准 尝试植物的组织培养 对应课题 课题1、课题2 通过本专题的学习，学生应当了解植物组织培养技术在生产中的应用，熟悉植物组织培养或花药培养的基本过程，了解影响植物组织培养或花药培养的各种因素，掌握培养
基制备、外植体消毒、接种、培养、移栽以及栽培等基本操作技术。
二、技术要项
本专题围绕植物组织培养的基本技术展开，主要技术归纳如下。 1.培养基的制备 2.外植体消毒 3.接种 4.培养 5.移栽 6.栽培 三、设备条件
完成本专题需要配备无菌室、洁净工作台或接种箱，此外还需配置常规植物组培用具，如高压锅、酒精灯、枪状镊、解剖剪、培养皿等。 四、教学安排
本专题的课题1以菊花的组织培养为例，介绍了有关植物组织培养的知识背景及操作技术，也是开展课题2的基础。课题2难度较大，教师可以根据实际情况选做。 植物组织培养的实验周期较长，需要一定实践经验的积累。建议教师先摸索出一套行之有效的办法，然后再安排学生实践。对于学生实践的安排，也可以课上课下结合进行。
例如完成一个植物组培的实验室操作至少需要3课时，因此，有些过程教师可以安排在课外提前做，课上集中让学生进行某些关键步骤的操作。
参考书目
1.实用植物组织培养技术教程。曹孜义、刘国民主编，甘肃科学技术出版社,1999。 2.植物细胞工程原理与技术。周维燕主编，中国农业大学出版社，2001。
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课题1 菊花的组织培养
一、课题目标
说明植物组织培养的基本原理，学习植物组织培养的基本技术，进行菊花或其他植物的组织培养。 二、课题重点与难点
课题重点：植物组织培养过程中使用的无菌技术。 课题难点：植物组织培养过程中使用的无菌技术。 三、课题背景分析
课题背景介绍了植物细胞的全能性，说明离体的植物器官或组织在一定的条件下能够发育成完整的植株。教学中，教师可以从植物组织培养的发展历史（参见下文的参考资
料）引入，激发学生的学习兴趣。
四、基础知识分析与教学建议 （一）植物组织培养的基本过程
知识要点：1.细胞分化的概念；2.离体植物细胞的脱分化和再分化。
教学建议：植物组织培养的基础知识对于学生来说还是有一定难度的。教师最好在课前准备已脱分化的愈伤组织和再分化的丛芽等材料，让学生在课堂上观察，以增进学生
的感性认识，帮助学生理解植物组织培养的基本原理。
（二）影响植物组织培养的因素
知识要点：影响植物组织培养的因素有培养基配制、外植体的选取、消毒、接种、培养、移栽和栽培等。
教学建议：影响植物组织培养的因素有很多。关于培养基，可以利用旁栏思考题，让学生通过与微生物培养基配方的对比来认识用于植物组织培养的培养基的特点。关于植
物激素的使用，可以引导学生阅读课本旁栏有关植物激素的介绍，还可以回顾高中必修教材《稳态与环境》模块中有关植物激素调节的内容。
五、实验安排及注意事项 （一）课时安排的问题
本课题耗时较长，需要提前做好计划。有关培养基母液的配制、培养基高压灭菌、组培苗的培养和继代以及栽培管理等工作，可在课下进行。如果课时紧张，外植体的消毒
和接种也可以在课下进行。课上学生只需做一些关键步骤的操作，如愈伤组织的继代、分化转瓶、丛芽继代、生根转瓶等。建议第一课时完成基础知识教学，学习操作方法并使用各种母液配制培养基。第二课时学习外植体接种或继代转瓶。此后学生可以利用课下时间做观察记录。第三课时做生根组培苗的移栽。大田栽培或盆栽管理工作可以在课外组织同学来做。
（二）无菌技术是植物组织培养能否获得成功的关键
植物组织培养不同于扦插、分根、叶插等常规无性繁殖。由于植物组织培养所利用的植物材料体积小、抗性差，所以对培养条件的要求较高，对无菌操作的要求非常严格。
如果不小心引起污染，将可能造成培养工作的前功尽弃。
无菌技术包括培养基消毒灭菌和植物材料（外植体）的消毒灭菌。对培养材料进行表面灭菌时，一方面要考虑药剂的消毒效果；另一方面还要考虑植物材料的耐受能力。不
同药剂、不同植物材料，甚至不同器官要区别对待。建议教师课前积极摸索成功经验，或先组织部分学生做外植体的接种，以培养实验骨干。课上让骨干学生介绍经验，帮助大部分同学完成任务。有条件的学校还可以将植物组织培养的全部过程拍摄成录像，供其他学生参考。
（三）妥善处理被污染的培养物
即使对于有经验的操作人员，操作后出现培养物被污染的情况也常有。一般情况下，细菌污染可能是由接种人员造成的，如未戴口罩，接种时说话，或手及器械消毒不严等。
真菌污染可能是植物材料灭菌不当。需要特别注意的是，一旦发现培养材料被污染，特别是真菌性污染，一定不要打开培养瓶。应先将所有被污染的培养瓶统一放在高压蒸汽锅内进行高压蒸汽灭菌，然后再打开培养瓶，进行清洗。
（四）有毒药品的用后处理
外植体灭菌用过的有毒药品要妥善处理（如氯化汞等），以免引起环境污染。一般应收集后统一交给有关专业部门处理。 六、课题成果评价
（一）对接种操作中污染情况的分析
接种3～4 d后，在接种操作中被杂菌污染的培养物会表现出被污染的现象。请学生适时统计污染率，分析接种操作是否符合无菌要求。 （二）是否完成了对植物组织的脱分化和再分化
观察实验结果，看看是否培养出了愈伤组织，记录多长时间长出愈伤组织。统计更换培养基后愈伤组织进一步分化成根和芽的比例和时间。 （三）是否进行了统计、对照与记录
做好统计和对照，填好结果记录表，培养严谨的科学态度。从实验的第一步开始就要求学生做好实验记录，可以让学生分组配制不同培养基，如诱导愈伤或直接分化丛芽的
培养基，然后做不同配方的比较。
（四）生根苗的移栽是否合格
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