《生物选修1：生物技术实践 教师教学用书》
（三）不同实验方法的比较
对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的纯度、DNA
的颜色、二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。
七、答案和提示 （一）旁栏思考题
1．为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？
答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从
而释放出DNA。
2．加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？
答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。 3．如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？
答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。 4．此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？ 答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。 5．为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？
答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除
去与DNA溶解度不同的多种杂质。
6．方案二与方案三的原理有什么不同？
答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。 （二）练习
1．答：提取DNA的第一步是材料的选取，其目的是一定要选取DNA含量较高的生物材料，否则会由于实验过程中或多或少的损失而造成检测的困难；第二步是DNA的释放
和溶解，这一步是实验成功与否的关键，要尽可能使细胞内的DNA全部溶解；第三步是DNA的纯化，即根据DNA的溶解特性、对酶及高温的耐受性的不同等特性，最大限度地将DNA与杂质分开；最后一步是对DNA进行鉴定，这是对整个实验的结果的检测。
2．答：提取蛋白质比提取DNA的难度大。这是因为，与DNA相比，蛋白质对温度、盐浓度、pH等条件要敏感得多，很容易失活；并且蛋白质的空间结构多种多样，理化性
质各不相同，使得蛋白质的提取没有一种统一的方法，只能根据特定蛋白质的特性摸索提取的条件，设计特定的方法。
八、参考资料
1.二苯胺鉴定DNA的化学原理
DNA中嘌呤核苷酸上的脱氧核糖遇酸生成ω-羟基-γ酮基戊醛，它再和二苯胺作用而呈现蓝色(溶液呈浅蓝色)。鉴定时溶液蓝色的深浅，与溶液中DNA含量的多少有关。 2.研磨液中几种药品的作用
Tris/HCl:提供缓冲体系，DNA在这一体系中呈稳定态（Tris为三羟甲基氨基甲烷）。 EDTA（乙二胺四乙酸二钠）：是DNA酶的抑制剂，可以防止细胞破碎后DNA酶降解DNA。 SDS（十二烷基磺酸钠）：可以使蛋白质变性，与DNA分离。
2005-03-31
课题2 多聚酶链式反应扩增DNA片段
一、课题目标
本课题通过尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基本操作，使学生体验PCR这一常规的分子生物学实验方法，理解PCR的原理，讨论PCR的应用。 二、课题重点与难点
课题重点：PCR的原理和PCR的基本操作。 课题难点：PCR的原理。 三、课题背景分析
课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速扩增DNA片段的技术，然后说明这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指
出本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，并尝试用PCR技术扩增DNA片段。教师在导入本课题的学习时，可以先让学生谈一谈对PCR的认识以及PCR的应用，以激发学生的学习兴趣，然后再说明本课题的目标。
四、基础知识分析与教学建议 （一）PCR原理
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知识要点：1.细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件；2.DNA的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的应用。
教学建议：理解PCR的原理，需要首先了解细胞内参与DNA复制的各种组成成分与反应条件。教师在教学过程中，可以首先引导学生回忆必修2《遗传与进化》中的有关DNA
复制的知识。在此基础上，学生需要进一步了解DNA双链的方向，能够区分DNA的3′端和5′端。此外，学生还需要了解DNA聚合酶的特性，如只能从DNA的3′端开始延伸DNA链、而不能从头合成DNA等。
Taq DNA聚合酶的应用，解决了高温导致DNA聚合酶失活的问题，促成了PCR技术的自动化，是一个重要的知识点。教师可以结合专题2中课题2“土壤中分解尿素的细菌
的分离与计数”Taq细菌的发现过程，帮助学生加深理解。
（二）PCR的反应过程
知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。
教学建议：这部分内容的教学应以读图识图为主。教科书中图5-9“PCR反应过程图解”详细地描绘了参与PCR的各组成成分；每一轮反应的三个基本步骤──变性、复性
和延伸；每一轮中每一个步骤所发生的变化，即每个步骤所具有的作用。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。
五、实验案例
PCR扩增双歧杆菌编码16SrRNA的DNA片段
1.双歧杆菌的培养。本实验用双歧杆菌作为实验材料，需要在实验前一天培养双歧杆菌。双歧杆菌的培养基配方如下。 大豆蛋白胨5.0 g 胰胨5.0 g 酵母提取物10 g 葡萄糖10 g 微量盐溶液40 mL 半胱氨酸盐酸盐0.5 g 0.1%（0.1 g/100 mL）刃天青 1 mL
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH至7.0。 其中，微量盐溶液的配方如下。
CaCl2 0.2 g MgSO4·7H2O 0.48 g K2HPO4 1 g KH2PO4 1 g NaHCO3 10 g NaCl 2 g
培养双歧杆菌24 h后，将菌液进行离心，双歧杆菌将沉淀在试管底部。
2．PCR操作。往双歧杆菌的沉淀中加入0.2 mL裂解液（裂解液配方为50 mmol/ L 的Tris-HCl , 0.5 %的Tween 20, 1 mg/ mL的蛋白酶K，pH为8.0），使细胞裂解，释
放出DNA。将裂解液在55 ℃温度下加热孵育3 h后，再在95 ℃温度下加热10 min，然后立即放入冰水中冷却。冷却后离心，将10 μL上清液转移到0.5 mL的离心管中，然后依次加入10倍浓缩的扩增缓冲液5 μL、25 mmol/ L 的MgCl2溶液3 μL，20 mmol/L的4种脱氧核苷酸的等量混合液1 μL，Taq DNA聚合酶1 μL(2U/μL)，蒸馏水29 μL，两种引物(25 μmol/ L) 各0.5 μL。混匀后按教科书表格中的数据设定PCR程序，进行反应。
需要说明的是，进行本实验可以直接购买试剂盒，试剂盒的价格比单独购买试剂的价格要低，并且包括了PCR所需的所有试剂。但是，试剂盒上往往只标出了试剂号，而没
有标明试剂的名称，因此购买时要进行详细的咨询。如果单独购买试剂，PCR所需的引物必须委托相关的试剂公司来合成，合成后必须低温保存，否则引物容易发生降解。本实验所用引物的碱基序列如下。
引物I 5′GGATTCTGGCTCAGGATGAACGG 3′
引物II 5′CCGGGTGCTICCCACTTTCATGG 3′( I 代表碱基次黄嘌呤, 它可以与A、G、C、T中的任何1个碱基配对)。
3．PCR产物的检测。产物的检测除了可以采用教科书中提供的方法外，还可以采用琼脂糖凝胶电泳的方法。琼脂糖凝胶电泳的有关介绍可参见本专题中课题3《血红蛋白的
提取和分离》以及本课题的参考资料，具体操作步骤如下。
（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。
（2）配制浓度为1%（1 g/100 mL）的琼脂糖凝胶。在锥形瓶中，称取一定量的琼脂糖粉，加入适量蒸馏水，在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60 ℃，倒入
电泳槽中，待其凝固。
（3）配制0.5倍的TBE电泳缓冲液100 mL。配制方法见本课题的参考资料部分。
（4）向电泳槽中缓缓倒入配制好的电泳缓冲液，以没过胶面2 mm为宜。小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。如果样品孔内有气泡，应设法除去。 （5）在DNA样品中加入相当于样品0.2倍体积的载样缓冲液（载样缓冲液的成分参见本课题中参考资料），混匀后，加入样品孔内。
（6）接通电源。一般红色代表正极，黑色代表负极。DNA样品是由负极向正极移动，因此要保证靠近加样孔一端的电极为负极。电压为1～50 V/cm(长度以两个电极之间的
距离计算)。
（7）当指示剂移动到凝胶边缘时，断开电源，终止电泳。一般200～400个核苷酸长度的PCR产物，在50 V电压下，电泳20～40 min即可。 （8）将凝胶放入溴化乙锭溶液中染色后，在紫外仪上观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。 六、课题成果评价 DNA片段的扩增是否成功
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检测DNA片段的扩增情况，既可以采用教科书中提供的方法，也可以采用教师用书中实验案例提供的方法。对于教科书中的方法，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果；
对于电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。如果扩增不成功，则要分析失败原因。可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。
七、答案和提示 练习
1.提示：绘图可参考教科书中图5-9。PCR反应中的目的片段一般以2n的方式积累，其中n为反应循环次数。一个DNA片段在30次循环后反应物中大约有10亿个这样的片
段（2n=230=1 073 741 824)。
2.提示：PCR引物是根据需要扩增的目标DNA的碱基序列来设计的。引物的设计需要丰富的分子生物学实验经验，感兴趣的学生可以参考《分子克隆实验指南》（见本专题
参考书目），书中有详尽的论述。
八、参考资料
1.琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系
凝胶浓度要依据DNA分子的大小来确定。编码双歧杆菌16srRNA的DNA片段大小约为1 500个核苷酸的长度，因此根据表4-1选用1％（1 g/100 mL，下同）的凝胶浓度。
表4-1琼脂糖凝胶浓度与DNA分离范围的关系
琼脂糖凝胶浓度(%) 0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5 12.0 2.核酸电泳缓冲液
核酸电泳缓冲液有三种，分别是Tris—硼酸(TBE)、Tris—乙酸(TAE)和Tris—磷酸(TPE)。在上述三种缓冲液中：TBE与TPE缓冲液容量高，对DNA的分离效果好，但TPE
液中含磷酸盐的浓度偏高，容易使DNA沉淀。TAE液的缓冲容量低，价格较便宜。本实验选用的是TBE缓冲液。缓冲液中的EDTA可螯合正价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR产物被降解。
10倍浓缩的TBE缓冲液配方如下。
Tris 108 g EDTA 9.3 g 硼酸 55 g
将上述物质溶解后，用蒸馏水定容至1 000 mL，调节pH为8.0～8.2备用，使用时需稀释10倍。 3.核酸电泳的指示剂与染色剂
核酸电泳常用的指示剂是溴酚蓝，溴酚蓝在碱性条件下呈蓝紫色。指示剂一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成载样缓冲液。载样缓冲液的作用是：能够增加样品密度，确保
DNA均匀沉入加样孔内；能够在电泳中形成肉眼可见的蓝紫色指示带，从而帮助预测核酸电泳的速度和位置；能够使样品呈现蓝紫色，使加样操作更方便。
核酸电泳后，需要染色才能在紫外线下观察到带型。最常用的染色方法是溴化乙锭染色法。溴化乙锭(EB)是一种荧光染料，有剧毒，因此操作时要非常小心。EB可嵌入DNA
双链的碱基对之间，在紫外线激发下，能发出红色荧光。染色的方法有两种。一种是在凝胶电泳液中加入EB，使其终浓度为0.5 μg/mL；一种是在电泳后，将凝胶浸入0.5 μg/mL的EB溶液中，染色10～15 min。当凝胶染色过深时，可以将凝胶放入蒸馏水中浸泡30 min后再观察。
4.PCR的常见问题
PCR实验很容易出现假阳性或假阴性的结果。出现假阴性结果的常见原因有：Taq DNA聚合酶活力不够或其活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关
以及PCR系统的建立欠妥当；循环次数不够；等等。当实验中出现假阴性的情况时，应首先在原来扩增的产物中再加入Taq DNA聚合酶，并增加5～10次循环。为了防止假阴性结果的出现，在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时，在提取DNA模板时，应特别注意避免提取物中含有抑制酶活性的污染物，如酚、氯仿等的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度的要求不高，但也不允许有机试剂的污染。PCR扩增的先决条件以及特异性的高低，很大程度上取决于引物与靶DNA的互补情况，尤其需要保证引物的3′ 端与靶基因互补。
PCR技术高度灵敏，极其微量的靶基因污染都会造成非目标DNA片段的大量扩增，因此模板DNA的污染是PCR假阳性结果的主要原因。此外，样品中存在靶基因的同源序列
也可能造成假阳性结果。为了避免因污染而造成的假阳性结果，PCR操作时要注意做到：隔离操作区，分装试剂，简化操作程序，使用一次性吸头等。 2005-03-31
课题3 血红蛋白的提取和分离
线型DNA分子的分离范围(千碱基对，kb) 5～60 1～20 0.8～10 0.5～7 0.9～6 0.2～3 0.1～2 28 / 36
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一、课题目标
本课题通过尝试对血液中血红蛋白的提取和分离，使学生能够体验从复杂体系中提取生物大分子的基本过程和方法，并了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理，
为今后学习运用这些技术打下基础。
二、课题重点与难点
课题重点：凝胶色谱法的原理和方法。
课题难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。 三、课题背景分析
课题背景通过当今生物科学在蛋白质研究领域的进展，说明提取、分离高纯度的蛋白质的重要性和必要性，进而明确地提出课题目的：以血红蛋白为实验材料，学习蛋白质
提取和分离的一些基本技术。教师可以发挥学生的主动性，让学生介绍当前有关蛋白质研究的新进展，激发学生的学习兴趣，然后指出本课题的学习意义，让学生初步体会分离纯化蛋白质的过程和方法。
四、基础知识分析与教学建议 （一）凝胶色谱法
知识要点：1.凝胶色谱法的用途；2.凝胶色谱法分离蛋白质的原理。
教学建议：教师在介绍凝胶色谱法的基本原理时，可以结合教科书提供的插图，让学生对凝胶色谱法分离蛋白质的过程有一个直观的认识。教师可以通过发动学生查阅资料，
让学生了解有关凝胶色谱法的知识，如凝胶的种类、理化性质及凝胶的选择和保存，并结合实验操作，让学生分析实验中的注意事项。教师还可以向学生介绍凝胶色谱法的其他用途，如测定生物大分子的分子量、蛋白质的脱盐等。
（二）缓冲溶液
知识要点：1.缓冲溶液的组成和作用机理；2.熟悉一般缓冲溶液的配制方法；3．缓冲溶液广泛应用于生化实验、微生物的培养、组织切片和细菌染色以及酶的研究等方面。 教学建议：教师首先可以结合生活中的一些缓冲现象，让学生充分理解缓冲溶液的重要性。在进行本课题的实验操作之前，可以让学生查阅相关资料，练习一些常用缓冲液
的配制。
（三）电泳
知识要点：1.电泳的基本原理；2.不同类型的电泳。
教学建议：电泳技术广泛应用于生化实验，在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子方面具有较高的分辨率。教师可以通过一个简单的实验使学生理解电泳现象，比如在
盛有红褐色Fe(OH)3胶体的U形管的两个管口，各插入一个电极。通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐变深，阳极附近的颜色逐渐变浅。这表明Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，在电场作用下向阴极移动。这种在外加电场作用下，带电粒子发生迁移的现象就叫做电泳。
教科书中用楷体字简单地介绍了聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理，教师可以结合资料，开拓学生的知识面，围绕聚丙烯酰胺凝胶电泳，介绍其他类型的电泳原理及应用。本
实验的选做部分是通过SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳对血红蛋白进行纯度的鉴定，同时也可以测定血红蛋白亚基的分子量。此外，还可以通过聚丙烯酰胺凝胶梯度电泳来测定天然蛋白的分子量；通过聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳来测定蛋白的等电点；等等。相关原理可以查阅生物化学技术的有关书籍。
使用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子
量的对数作标准曲线，可以测出未知蛋白的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。
五、实验安排及注意事项
（一）第1课时完成基础知识的教学。教师需要用简单直观、通俗易懂的方式讲解凝胶色谱法和电泳的基本原理。教师可以根据学生的接受情况，适当增加一些相关知识的
教学，加深对本课题的理解。第1课时还要学习缓冲溶液的配制。本课题所用的缓冲液是20 mmol/L的pH7.0的磷酸缓冲液。
在pH5.8～8.0的缓冲范围内，磷酸缓冲液的配制方法见下表。配制前需要准备0.2 mol/L的Na2HPO4溶液和0.2 mol/L的NaH2PO4溶液。Na2HPO4溶液的配制方法：将71.64
g的Na2HPO4·12H2O溶解在1 000 mL的蒸馏水中。NaH2PO4溶液的配制方法：将31.21 g的NaH2PO4·2H2O溶解在1 000 mL的蒸馏水中。
0.2 mol/L pH NaH2PO4/mL 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 8.0 12.3 18.5 26.5 37.5 49.0 NaH2PO4/mL 92.0 87.7 81.5 73.5 62.5 51.0 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 0.2 mol/L pH NaH2PO4/mL 61.0 72.0 81.0 87.0 91.5 94.7 NaH2PO4/mL 39.0 28.0 19.0 13.0 8.5 5.3 0.2 mol/L 0.2 mol/L 29 / 36
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（二）第2课时进行凝胶色谱柱的制备。教材中已经详细地介绍了凝胶色谱柱的制作，教师可根据学生小组的数目，课前准备好所需的材料。值得一提的是，凝胶色谱柱直
径的大小不影响分离的效果，但是直径过大会造成洗脱液体积增大，样品的稀释度过大，因此应选择直径不超过2 cm的色谱柱。凝胶色谱柱的高度与分离度有关，一般不超过1 m。在装填凝胶前，一定要按教材描述的方法将凝胶充分溶胀，溶胀时可以用蒸馏水，也可以用洗脱缓冲液。如果发现凝胶的表面不平，可以用玻璃棒将表面的凝胶轻轻搅起，让其自然沉淀至表面平整。凝胶装填完毕一定要充分洗涤平衡，可以平衡过夜，但切记不得发生洗脱液流干、露出凝胶颗粒的现象，否则凝胶色谱柱需要重新装填。
（三）第3课时进行样品的处理。教师可以在课前从学校附近的屠宰场索取新鲜的猪血，切记要在采血容器中预先加入抗凝血剂柠檬酸钠。取血回来后，马上进行离心。血
红蛋白溶液在透析袋中可以透析过夜。建议教师第2课时和第3课时在同一天进行，这样可使凝胶色谱柱的平衡和血红蛋白溶液的透析同时进行。
（四）第4课时进行血红蛋白的提取。此步骤是本课题的关键，每一步操作都要按照教科书的要求进行。加样前可以在样品中加入质量分数为1%的葡萄糖或蔗糖（糖不会干
扰分离效果），以调节样品的比重，使之稍大于洗脱液，从而缩短加样时间。如果样品出现浑浊、有沉淀，可以离心或过滤后再加样。在实验过程中，洗脱液的流速也是影响分离效果的重要因素之一，因此，洗脱时应维持流速的恒定，即维持洗脱液加在色谱柱上的压力恒定。有条件的学校，可以在洗脱液瓶与凝胶色谱柱之间加一个蠕动泵来控制洗脱液的流速，以保持恒定。
（五）由于血红蛋白呈现红色，因此分离过程中能够观察到一条红色的带向下移动的现象，实验结果也一目了然。收集到红色的流出液就可以确定提取到了血红蛋白。有条
件的学校，可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法鉴定血红蛋白的纯度。具体操作参见本课题参考资料。
（六）实验结果如果不理想,需要重做时，必须进行凝胶色谱柱的再生。一般情况下，凝胶不会与其他溶质发生任何作用，因此，在一次分离以后，稍加平衡就可以进行下
一次的操作。平衡时，需用3倍柱体积的洗脱液过柱。如果实验操作中有一些杂质污染了色谱柱，可以用物质的量浓度为0.2 mol/L的氢氧化钠和物质的量浓度为0.5 mol/L的氯化钠混合液处理交联葡聚糖凝胶。如果凝胶长期不用，可以加入浓度为0.02%的叠氮钠、0.01% 的三氯丁醇和物质的量浓度为0.1 mol/L的氢氧化钠等抑菌剂低温保存，使用时再进行充分的平衡。
六、课题成果评价
（一）是否完成对血液样品的处理
观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细
胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。
（二）凝胶色谱柱的装填是否成功。
由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖—2000
或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。
（三）血红蛋白的分离是否成功
如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明
分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。
七、答案和提示 （一）旁栏思考题
你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？
答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，
移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。
（二）练习
1．答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构
成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。
2．答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一
或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。
缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟
生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。
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