培养基—————高温高压（120℃，21min）、微孔滤膜灭菌 玻璃器皿、用具---与培养基一起灭菌，部分用具酒精火焰灭菌。 接种室、超净台---紫外灯20min
培养室---————保持洁净；减少进出
实验人员————手酒精消毒，穿工作服。
第二节?植物细胞工程
一、理论基础
植物细胞全能性（totipotency）是指植物的每个细胞都包含着该物种的全部遗传信息，都具备发育成完整植株的遗传能力。 在适宜条件下，任何一个细胞都可以发育成一个新个体。它是植物组织培养的理论基础。
问题1 植物体上的细胞全能性大小是否有区别？ 答：受精卵>生殖细胞（卵）>体细胞 体细胞已经分化为组织和器官。 二、植物细胞工程的基本技术手段 （一）植物组织培养
看录像回答问题（5.30min开始） 问题1 什么是脱分化和再分化？
1）已分化（或成熟）的组织又恢复到无分化的初始状态。
2）处于脱分化状态的愈伤组织进行培养，诱导其形成新的植物体的过程。 问题2 已分化的细胞如何培养成植物器官或植物体？ 1.配制培养基
MS培养基、LS和RM培养基、N6（氮6）培养基等等。 2.外植体选择与处理
外植体：能被诱发产生无性增殖系的器官或组织切段 。 器官来源------一般以幼嫩的组织或器官为宜。
切块大小----组织块要达到2万个细胞（即5～10mg）以上
外植体→自来水多次漂洗→消毒剂处理→无菌水反复冲洗→无菌滤纸吸干。 3.诱导去分化阶段
较高浓度的生长素和少量的细胞分裂素。
愈伤组织---原指植物受创伤伤口附近产生的薄壁组织，泛指经细胞与组织培养产生的可传代的未分化细胞团。 4.继代增殖阶段
5、生根成芽（再分化）阶段 6、移栽成活阶段
（二）植物细胞培养和次生代谢物的生产
以离体的植物单细胞或细胞团为外植体，在无菌条件下通过诱发细胞分裂形成细胞团，再分化形成具有芽、根的完整植株。
1.悬浮细胞培养----细胞生长旺盛、次生物质积累少
①原代培养：从形成愈伤组织的培养瓶中，挑取质地松弛、生长旺盛的愈伤组织2g放入盛有30m1液体培养基的三角瓶，用镊子轻轻捏碎,置于25℃黑暗或弱光下震荡摇床固定培养
②继代培养(多次)：18～25d后，将培养物摇匀，静置片刻，用吸管吸取培养基中部的培养物（细胞团小，可清除较大细胞团块和接种物残渣），加入另一无菌三角瓶中，然后添加新鲜培养基。
③悬浮细胞同步化：分级过筛分离和不连续密度梯度离心，便于进行体细胞胚胎发生及其生理生化机制的研究。
2.固定化细胞培养----细胞生长缓慢，次生物质含量较高。
将细胞包埋在褐藻酸钙（惰性支持物）的内部或贴附在它的表面。前提是通过悬浮培养获得足够数量的细胞。
（三）植物体细胞杂交（细胞融合技术） 看录像回答问题
1.什么是细胞融合和细胞杂交？
1）两个或多个细胞相互接触合并、染色体等遗传物质重组的过程。
2）来自不同植物体细胞融合成一个杂种细胞，且把杂种细胞培育成新的植物体的方法。 2. 细胞融合包括哪些步骤？
⑴步骤①是去掉 ，使植物细胞成为 ，最常用的方法是 。 ⑵步骤②一般常用的化学试剂是 ， 目的是 。
⑶在利用杂种细胞培育成为杂种植株的过程中，运用的 技术手段是 ，其中步骤④相当于 ， 步骤⑤相当于 。
1.什么是细胞融合？简述植物细胞融合过程？ 2.植物组织培养包括哪几个步骤？
3.什么是悬浮细胞培养和固定化细胞培养？各有何优缺点？
4.自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼虫，说明植物的细胞器同样可以在某些动物细胞中存活，请探讨：动物细胞与植物细胞之间可以实现杂交吗？如果理论上可行，请设计出具体实验方案。
第四章 发酵工程
第一节 概述 一、发酵工程的定义
在最适发酵条件下，发酵罐中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。 从广义上讲，由三部分组成：
上游工程、中游工程（发酵）、下游工程
优良菌株的选育、发酵条件的确定、培养基等营养物质的准备。 发酵过程控制
发酵液的预处理、固液分离、纯化、干燥处理（真空干燥和冰冻干燥） 二、发酵工业必须具备的条件 ?某种适宜的微生物
?发酵条件（培养基组成、温度、溶氧浓度、PH等） ?发酵设备
?分离纯化方法及设备 三、发酵工程的内容
?微生物菌体发酵（如药用真菌） ?微生物酶发酵（酶的生产） ?微生物代谢产物发酵（氨基酸等） ?微生物转化发酵（乙醇转化为乙酸） ?生物工程细胞发酵（工程菌、杂交细胞发酵） 四、发酵工程的应用
第二节 生物反应器及发酵系统 一、概述
（一）定义：是人们对生物有机体进行有控制的培养以生产某种产品或进行特定反应的容器。包括：传统发酵罐、酶反应器等、固定化酶和细胞反应器、动植物细胞培养反应器。 (二)分类
1、根据细胞或组织的代谢要求等划分
（1）厌氧生物反应器（2）好氧生物反应器（3）光照生物反应器（4）膜生物反应器 2、根据容积划分
实验室、中试、生产规模发酵罐 二、微生物细胞反应器——发酵罐
按能量（使液体循环）的输入方式分：机械搅拌式（机械搅拌）、气升式（气体喷射）、自吸式（利用泵对液体的喷射作用）。 1.机械搅拌型发酵罐（通用型发酵罐）
1.机械搅拌通风发酵罐（通用型发酵罐）
优点：PH和温度易控制、溶氧好。缺点：搅拌功率消耗大，结构复杂不易清洗。 2. 自吸发酵罐
有机械搅拌、喷射自吸发酵罐两类 3.气升式发酵罐 (二)厌氧发酵罐
思考（1）是否需要供氧？（2）是否需要搅拌装置和空气压缩机吗？（3）如何保证上层氧气排除？
答：不需供氧；无；尽量装满，排除上层氧气 三、固体发酵设备
四、动植物细胞培育反应器
有搅拌式、气升式、中空纤维（杂交瘤细胞）、膜生物反应器、填充床生物反应器等等。 1、动物细胞悬浮培养反应器 2、动物细胞贴壁培养反应器 3、动物细胞微载体悬浮培养反应器 (二)植物细胞培养生物反应器 (三)微藻培养光合生物反应器 （1）地球上预计有多少种？ （2）富含哪些成分？ （3）产油率如何？
（4）如何达到最大生产力？
（5）荷兰设计了几种光合生物反应器进行蓝藻培养试验？
（1）何为微藻——含有叶绿素A并能进行光合作用的微生物的总称，80多万种，截止2012年已知2万余种，D=5μm。
（2）成分： 含有蛋白质、脂类、藻多糖、β-胡萝卜素、多种无机元素。 （3）产油效率如何？
在一年生长期内，1ha大豆能产446L，而微藻能产生物质燃油95000L。 （4）有大量培养或生产的微藻有哪些？ 分属4个藻门：蓝、绿、金、红藻门。 （5）达到最大生产力需要的条件？ ---初期足够的光进行光合作用，接下来营造 恶劣的环境（为了自保产生油脂和营养素） 第三节 发酵工程工艺 一、菌种选育与种子扩大培养
(一)菌种选育
从自然界直接分离；人工诱变筛选获得突变株 ；经基因工程、细胞工程改造成的工程细胞或工程菌。
(二)种子扩大培养（种子制备）
（1）将沙土孢子或冷冻孢子接种到斜面培养基中活化培养； （2）移种到扁瓶固体培养基或摇瓶液体培养基中扩大培养； （3）种子罐扩大培养； （4）种子进罐培养（发酵）。 二、培养基制备 (一)种类
1、按营养物质来源 天然、合成培养基 2、按状态 液体、半固体、固体培养基 3、按用途（从发酵生产应用考虑） 孢子、种子、发酵培养基 (二)发酵培养基组成
碳源：葡萄糖、糖蜜、淀粉和糊精；
氮源：有机氮源——花生饼粉、黄豆饼粉、玉米浆、玉米蛋白粉、蛋白胨、酵母粉、鱼粉、蚕蛹粉、尿素、废菌丝体和酒糟等。
无机氮源——氨水、硫酸铵、氯化铵、硝酸盐等； （混合使用—早期利用无机氮，中期酶系形成可用有机氮） 无机盐：镁、硫、磷、铁、钾、钙、钠、氯、锌、钴、锰等； 生长因子 前体物 三、灭菌
问题1 在发酵生产中，为什么要进行灭菌操作？ 答：（1）杂菌消耗培养物质。
（2）杂菌及产物导致产物分离提取困难。 （3）杂菌繁殖会改变反应介质的PH值； （4）杂菌可能会分解产物；
（5）发生噬菌体污染，微生物细胞被裂解 问题2.消毒与灭菌的区别？
消毒：杀死物体表面及内部一部分对人体有害的病原菌的营养体，而对被消毒的物体基本无害的措施，如对皮肤、水果等
灭菌 ：杀死任何物体内外的一切微生物的方法，灭菌后的物体不再有可存活的微生物。 问题3 灭菌 方法有哪些？