实验目的、原理、材料、内容、结果、分析讨论
实验目的
嗜热链球菌的筛选、分离鉴定及发育树鉴定
实验原理
乳酸菌是一类能利用可发酵的糖产生大量乳酸的细菌通称。这类细菌广泛分布在土壤 植物根、茎、湖泊及动物的体内。乳酸菌从形态上可以分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性。在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧菌或厌氧性细菌。
嗜热链球菌来源于乳制品。它是一种耗氧的革兰氏阳性菌，以两个卵圆型为一对的球菌连成约0.7到0.9微米的长链。在选择性培养基，嗜热链球菌会长成米色的菌落。嗜热链球菌也可在含有下列任一种糖类的培养基上生长。这些糖类包括半乳糖、葡萄糖、果糖、乳糖、蔗糖。 乳糖的降解需要一种特殊的酶，叫β-半乳糖苷酶。乳糖不耐受的人身体内就是缺乏了这一种酶。嗜热链球菌是一种能产生β-半乳糖苷酶的细菌，所以可以帮助乳糖的消化。 嗜热链球菌个体中多有2球体连接、3、4球体连接、5、6球体连接的，8球体以上连接的和单球体的少见。所以个体大小差距较大。多在0.4-0.7×1.0-6um范围内。
利用是嗜热链球菌的选择性培养基——改良型M17培养基，可以筛选出酸奶中的嗜热链球菌，然后进行筛选并分离纯培养。
传统的微生物分类主要依靠形态学特征以及生理生化特征进行，这些方法在微生物分类鉴定中发挥过重要作用，但也存在着鉴定准确性差、繁琐耗时等缺点。目前细菌的分类鉴定开始进入分子水平, 各种基因型分类方法也应运而生, 如(G+ C)mo l%、DNA 杂交、rDNA 指纹图、质粒图谱和16Sr DNA 序列分析等等。细菌16S rDNA以及丝状真菌（及酵母）的核糖体rDNA内部转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)序列分析鉴定已经被大多数研究者所接受和采用，成为一种常用的微生物鉴定方法。rRNA 是研究细菌进化和亲缘关系的重要指标, 它含量大(约占细菌RNA 总量的80% ) , 并存在于所有细菌中。rRNA 基因由保守区和可变区组成, 在细菌中高度保守, 素有“细菌化石”之称, 是细菌系统分类学研究中最有用和最常用的分子钟。原核生物的rRNA 分为3 种, 分别为5S rRNA、16S rRNA 和23S rRNA , 并且它们位于同一操纵子上。 rRNA 的基因在大多数原核生物中都具有多个拷贝, 拷贝数目从1 到14 不等。其中, 16S rDNA 序列分析已经成为细菌种属鉴定和分类的标准方法, 大约2500 个种的16S rDNA 全序列已经被报道。根据它们的序列同源性, 已经构建了各种属的系统发育树。 也是进行微生物资源快捷鉴定的重要方法。
16S rDNA以及ITS序列的扩增需要微生物染色体DNA作为模板。首先提取微生物的染色体DNA，以此为模板，加入通用引物进行扩增，对扩增出来的片段提交至NCBI-BLAST网站进行序列比对，最终得知该微生物的种属归类。
实验材料
改良型M17琼脂培养基：蛋白胨10.0g、牛肉膏5.0g、酵母浸膏2.5g、抗坏血酸0.5g、硫酸镁0.25g、甘油10.0g、磷酸甘油二钾5.0g、乳糖3.0g、琼脂11.0g、蒸溜水1000ml DNA扩增溶液体系：16sRNA上游引物、16sRNA下游引物、Taq酶
溶液和试剂：去离子水、结晶紫溶液、碘液、95%酒精、刚果红溶液
仪器：超净工作台、高压灭菌锅、培养箱、 显微镜、PH试纸、分析天平、移液枪及枪头、EP管、PCR仪、电泳仪、烧杯、量筒、锥形瓶、接种环、水浴锅、培养皿、纱布、绳子、试管、酒精灯、培养箱
实验内容
1.培养基的配置与灭菌：准备仪器，并按照培养基培养，配置1000ml改良型M17琼脂培养基，倒100ml于锥形瓶中，盖8层纱布后，于高压灭菌锅121℃灭菌30min。配置5根装有4.5ml去离子水的试管，也置于灭菌锅灭菌。其他相关仪器也一同灭菌。
2.培养基的制备：将灭好菌的培养基溶液，在没有凝固前，在无菌条件下导入培养皿，培养基凝固待用。
3.原材料准备：购买光明畅游酸奶一瓶，并在无菌条件下抽取0.5ml，置于装有4.5ml去离子水的试管中，制成为10-1浓度的原料液，然后再从此试管中，吸取0.5ml置于装有4.5ml去离子水的试管中，制成为10-2浓度的原料液，以此进行，制成10-6浓度的原料液。
4.菌体培养：吸取1.5ml 10-6浓度的原料液均匀涂洒在培养基上，与培养箱中37℃培养24h。 5.观察形态并染色:取出已经培养24h的培养基，观察该培养基，鉴别该培养基上长出的菌落，挑选出进行染色，观察形态。 6.分离纯培养：于无菌环境，挑起长出的菌落，接种到另一个培养皿中，继续与培养箱中37℃培养24h。
7.观察形态及鉴别是否为纯种：取出培养皿，挑取菌落，染色并观察形态。挑选出嗜热链球菌菌落。
8.菌体模板的制作：吸取200μl的去离子水到灭菌的EP管中，在无菌条件下，用接种环挑取少量菌体到水中，100℃水浴5min。
9.PCR反应体系的制备：按照比例24μl 去离子水、1 μl模板、2.5μl上游引物、2.5μl下游引物、30μl 2×Taq酶制备60μl的反应体系，并以20μl为一管，分装到3个EP管中。
10.PCR扩增：将EP管置于PCR仪进行扩增。PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，52℃退火1min，72℃延伸90 s，经过30个循环后，72℃再延伸10 min。 11.琼脂糖凝胶电泳与测序：取5μL PCR产物进行电泳检测。电泳结束后在凝胶成像系统上观察结果。将PCR条带明显的进行测序。
12.测序结果分析：将测序结果用Sequence Scanner V1.0软件进行分析，查看序列的长度及可信度（图1）。
图1 Sequence Scanner V1.0软件分析界面
图中红色方框内所示的蓝色区域代表测序结果中可信度较高的序列。
选择测序结果中可信度较高的序列，将选定的序列提交至NCBI-BLAST网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行序列比对（图2）。
图2 NCBI-BLAST界面
将选定的序列粘贴入红色方框内的文本框进行比对，在Database选项中选择others，然后点blast按钮。
13.种属分类：根据BLAST比对结果中显示的16S rDNA/ITS序列相似度高低来确定待鉴定菌株的种属分类（图3）。
图3 BLAST比对结果界面
14.发育树构建：
实验结果
在改良M17培养基上过夜培养了酸奶稀释液后，得到了如图4的结果，该培养基上长了三种菌，分别挑取之后，再在另一个有改良M17培养基的培养皿中过夜纯培养，结果如图5
所示。
图4 改良M17培养基培养酸奶稀释液24h后图
图5 酸奶培养后挑取菌落纯培养结果图
图5中，标识为大的经过镜检为嗜热链球菌。对其进行染色检验后，图6为结晶紫染色图，
图7为革兰氏染色图，图8为对照四联球菌革兰氏染色图，图9为对照大肠杆菌革兰氏染色图。
图6 结晶紫染色图
图7 革兰氏染色图