图8 对照四联球菌革兰氏染色图
图9 对照大肠杆菌革兰氏染色图
经过专业的测序机构测序后，得到了16sRNA的测序结果：
TATTCTCGGGCTATCTGCAGTAGACGCTGAAGAGAGGAGCTTGCTCTTCTTGGATGAGT
TGCGAACGGGTGAGTAACGCGTAGGTAACCTGCCTTGTAGCGGGGGATAACTATTGGAAACGATAGCTAATACCGCATAACAATGGATGACACATGTCATTTATTTGAAAGGGGCAATTGTTCCACTACAAGATGGACCTGCGTTGTATTAGCTAGTAGGTGAGGTAATGGCTCACCTAGGCGACGATACATAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCATACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCGGCAATGGGGGCAACCCTGACCGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTAAGTCAAGAACGGGTGTGAGAGTGGAAAGTTCACACTGTGACGGTAGCTTACCAGAAAGGGACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTCCCGAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTGATAAGTCTGAAGTTAAAGGCTGTGGCTCAACCATAGTTCGCTTTGGAAACTGTCAAACTTGAGTGCAGAAGGGGAGAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAGGAACACCGGTGGCGAAAGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGATCCTTTCCGGGATTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCGATGCTATTTCTAGAGATAGAAAGTTACTTCGGTACATCGGTGA
将该序列应用序列分析软件Sequence Scanner进行分析，分析结果如图10所示，选取其中蓝色部分，其可信度较高，将其提交至NCBI网站进行序列BLAST序列相似度比较。
图10 测得序列运用Sequence Scanner分析图
将所得的可信序列，提交至NCBI进行BLAST，说的结果如图11所示，如结果所示，本组所分离出的菌确实是为嗜热链球菌，该菌的序列与NCBI网站的嗜热链球菌序列FR875178 Streptococcus thermophilus JIM 8232 complete genome相似度为99%。直接使用NCBI网站自带的发育树构建程式，得到图12所示的本组分离得到的菌体的发育树。其中用黄色标出的为 lcl|33289 为此次提交进行测序的菌体的ID。
图11 NCBI数据库BLAST可行序列后的结果图
图12 用NCBI自带发育树构建系统构建的发育树
分析与讨论
培养基配制和菌的培养：
在这次实验中，我们最开始的目标是从酸奶中分离出1—2种纯种菌株。为此我们针对不同的细菌，选择了三种培养基配方：改良型MRS培养基，LC培养基和改良型M17培养基。其中前两种是针对乳酸菌的，而最后一种是针对嗜热链球菌的。其中MRS培养基的优化是在其中加入了碳酸钙，因为乳酸杆菌会分泌产生乳酸，使得培养基的pH会随着培养时间的增加而降低，到最后过低的pH可能会抑制乳酸菌的生长，所以我们加入了不溶的碳酸钙，以保证整个培养过程中，培养基pH变化不会过大。并且乳酸菌生长分泌的乳酸会使白色的碳酸钙溶解变为无色，在培养基中形成透明的钙溶圈，以方便最后挑选分离菌株。
改良型M17培养基主要改良的地方是用甘油代替了原先的磷酸甘油二钠，减少了培养基中磷的含量，其他的就是减少了乳酸的用量。这种培养基利用了嗜热链球菌可以产生β半乳糖苷酶的特点，以乳糖为碳源，对嗜热链球菌进行加富性选择培养。
但是最后的实验结果很遗憾的是在前两种培养基上乳酸菌的生长并不良好，成长缓慢，以至于无法进行接下来的分离扩增。而嗜热链球菌生长良好，从接种到成长至肉眼可见的菌落，只需在37℃下24小时左右。我们怀疑前两种培养基的失败是由于我们将酸奶样品在从冰箱中取出后直接进行稀释涂布。乳酸菌在低温下的环境下储存时间太久，直接被转移到新的环境下，大部分乳酸杆菌处于休眠状态，需要有较长的迟滞期。实验时，我们应先将酸奶在室温下保存一段时间，使得其中的乳酸菌的活性恢复，这样可以减少接种后乳酸菌的迟滞期。同时，乳酸杆菌是兼性厌氧菌或厌氧菌，所以最好是能放在氧浓度较低的环境下培养。
而在这次配制培养基的过程中，我们除了注意到了在配置时应先将磷酸盐和镁盐、钙盐分开溶解后在混合这点以外，在配制我们的改良型M17培养基时，我们还注意到对于一些在高温下易分解的物质如抗生素、维生素等，应在培养基灭菌冷却后再加入。对于这些热敏性物质，我们应先将其溶解成液体后，再经过过滤除菌，加入灭好菌的培养基中。 纯化分离：
在进行分离纯化时在初培养的改良型M17培养基上已经长出了很多的单菌落。我们挑取了其中3种具有代表性的单菌落，在一块新的M17培养基上划线分离，并培养。结果果然获得了3种完全不同的细菌，其中1种白色的菌落，经过结晶紫染色后，由实验材料推断可能是乳酸杆菌（图8）。而图7是某种球菌，可能是乳酸乳球菌，也可能是酸奶灭菌不彻底留下的杂菌。最后我们选择了成长最好的嗜热链球菌进行之后的实验。 染色及镜检：
在进行染色时，很多之前学过的实验方法都记不清楚了。不过在老师的指导之下，还是顺利的完成了整个挑菌，染色，镜检的过程。从结晶紫染色中，可以清晰看到菌体呈球状，并且数个菌体连在一起形成链状。在革兰氏染色的过程中，第一次实验，在脱色的过程中，可能是脱色过度，最终的染色结果都相对偏红。革兰氏阴性菌和阳性菌的差别并不明显。在第二次减少了酒精脱色次数后，镜检发现阳性菌和阴性菌之间差别明显，而嗜热链球菌明显呈阳性，但是其颜色和四联球菌染色后的紫色还是有明显差别，似乎没有受到刚果红复染的影响。我们意识到了革兰氏染色的阳性菌与阴性菌的标准并不是一定的，色彩的差异会随着每次操作时，实验材料和操作上的略微不同，而产生颜色上的差异。所以每次作革兰氏染色时，都要做阳性菌和阴性菌的对照，通过颜色的比照，确定样品是阳性还是阴性。 PCR及菌种鉴定：
最后是在PCR的过程中，第一次的PCR条带很淡，但是重做后条带恢复了正常。第一次可能是在分配PCR溶液时，有些溶液加入的量偏少，溶液没有分配均匀。在做多管PCR反应体系时，可以一次性将除样本外的其他溶液按比例放大后，加在一个管中混合均匀后分装入其他小的EP管中，最后分别加入DNA模板。这样避免了多次微量加液可能会带来的误差，
减少了不同管间溶液体系的差异，也可以加快实验速度。在第二次PCR之后条带清晰，且无拖尾现象。PCR出现非特异性扩增可能是因为16SrDNA上存在与引物序列相类似的序列。可以通过提高退火温度来提高反应特异性。因为我们的16SrDNA比对结果是100%的相似性，所以PCR的模板是纯的。
根据16SrDNA序列的比对结果，我们基本可以确定此次分离培养所得的菌株为嗜热链球菌。匹配度只有99%，可能是应为该菌株的16SrDNA序列上可能有个别碱基发生突变。16SrDNA测定的缺点在于只能针对细菌，且只能鉴定到菌的属，要鉴定到种还需做其他的实验。
最后感谢老师在这次实验中的精心指导，让我对整个大学的微生物实验有了一个重温，并且相比之前的实验，在通过了系统的学习微生物学后有了更多的收获和感想，对实验中存在的问题，有了新的认识。
毛鑫磊