第一章
重组DNA技术：将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
基因工程：重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；
下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
遗传工程：采用基因工程方法和技术人工改造生物遗传性，细胞融合，花粉培育，常规育种、有性杂交。 生物工程：包括基因工程、细胞工程、酶工程、发酵工程（生化工程）、蛋白质工程 基因工程的三大理论基础： 1. 生物的遗传物质是DNA
2. 明确了DNA的双螺旋结构、中心法则 3 遗传密码子的破译
基因工程的三大技术发明：限制性内切酶和连接酶：DNA的“手术刀”与“缝纫机”
载体：运送遗传物质的工具，如质粒、病毒等
逆转录酶：从mRNA到 DNA，使真核基因制备成为可能
基因工程研究内容：
目的基因的获得
目的基因与载体的连接成重组DNA分子 重组DNA分子导入受体细胞 筛选重组克隆
基因表达与产物分离
第二章
基因工程基本操作技术：核酸的凝胶电泳，PCR技术，分子杂交，基因突变技术。 1、PCR (polymerase chain reaction) 技术 ①变性
变性不完全：导致PCR失败，未完全变性的双链DNA会很快复性，减少DNA产量； 变性时间过长或温度过高：导致聚合酶活性下降，扩增效率降低 Taq酶活性的半衰期为：92.5度130 min; 95度40 min; 97度5min ②退火
引物退火的温度和所需时间取决于引物的碱基组成、引物的长度，引物与模板的匹配程度及引物的浓度。
退火温度越高，所得产物的特异性也越高
实际使用的退火温度双扩增引物的Tm值低5-10度 退火温度的选择
两条引物间的Tm值相差小于5℃，最好1℃。
退火温度以两条引物中Tm值较低的为准，并且低5-10 ℃ Tm=（A+ T）X2+（C+ G）X4+ 3.3℃
A T C G指引物与模板直接配对的部分，外加碱基不算。 ③延伸
延伸反应通常在72度进行，接近Taq酶的最适温度75度。
在一般反应体系中， Taq酶每分钟可以合成约2kb长的DNA片段。
在能完成DNA合成的前提下应尽量缩短延伸时间，减少Taq酶活性的损失。
（1）引物（P31）
DNA聚合酶需要一小段双链DNA来启动新链的合成。
所谓PCR扩增引物，是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片段，其长度在15－30个核苷酸之间。
上游引物，是与基因的5?端互补的寡核苷酸，用于扩增编码链；
下游引物，是与基因的3?端相同的寡核苷酸，用于扩增DNA模板链。 两引物在模板DNA上结合之间的距离决定了扩增区段的长度。
实验表明，1kb之内是理想的扩增长度；2kb是有效的扩增长度；3kb以上则难上有效的扩增。
设计引物的基本原则
①引物长度：15-30 b，指模版与引物相配对的碱基数；应随机排列，避免同一碱基串联。 e.g. 引物长度为8个核苷酸：48＝65 536 bp 43 000个可能
17个核苷酸：417＝17 179 869 184 bp 超过5倍 人类基因组DNA长度：3×109 bp ②可以在5?端加适量的保护碱基或酶切位点序列 原因：5?端的无关序列不会影响引物特异序列的退火 引物的3?末端和模板的碱基要完全配对
③防止引物对间及引物内的同源性，尤其是3?端不能出现碱基同源，3?最好不出现碱基A ④GC的合理含量（P32）与Tm值的范围 目的ＤＮＡ：５?－ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC CGC ACT TCG GAC-----------------CTC CTA AGA CAC TCT CTA CAG-3?
上游序列：５?－ ATG GGA AGC TGC TGT TAC CTC －３? G+C含量=？% 下游序列：５?－CTG TAG AGA GTG TCT TAG GAG-3? G+C含量=？% ⑤引物的设计软件：
Oligo 6, Premier Primer, DNAstar, FastPCR etc. 其他概念：简并引物，嵌套引物 2、反转录 PCR(RT-PCR)
反转录PCR：先将mRNA反转录成cDNA，然后再以cDNA为模板，用PCR方法加以扩增。 mRNA---cDNA------PCR
抽提RNA 、反转录合成cDNA、PCR 扩增
3、实时荧光定量PCR
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法
实时PCR技术原理 4、巢式PCR（nested PCR）
巢式PCR（nested PCR）是一种PCR改良模式，它使用巢式PCR引物来增强反应的敏感性和特异性，巢式PCR方法由两轮PCR扩增和利用两套引物对所组成，在第一轮扩增中，使用一对外引物产生扩增产物，然后用一对内引物对第一轮扩增产物进行第二轮扩增。 5、RACE技术
RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法
分为5?-RACE和3?- RACE 5 ’ RACE原理
5?-RACE的原理是先是利用mRNA的3?末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30作为锁定引物在反转录酶MMLV（或AMV）作用下，反转录合成标准第一链cDNA。 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5?末端时自动加上3-5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延伸而连上通用接头。
然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为上游引物，用一个基因特异引物2作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5?末端的cDNA片段扩增出来 3 ’ RACE原理
利用mRNA的3?末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以连有SMART寡核苷酸序列通用接头引物的Oligo(dT)30MN作为锁定引物反转录合成标准第一链cDNA。
然后用一个基因特异引物GSP1作为上游引物，用一个含有部分接头序列的通用引物UPM作为下游引物，以cDNA第一链为模板，进行PCR循环，把目的基因3?末端的DNA片段扩增出 6、常用的分子杂交有哪些？ （1）Southern印记杂交 （2）Nouthern印记杂交 (3) 菌落原位杂交 （4）组织原位杂交 （5）斑点杂交
（6）Western blotting
第三章 同裂酶:识别同一序列且在同一位置(有时不)切割DNA的内切酶。
同尾酶:识别并切割不同序列但酶切产生互补末端的内切酶。
连接酶：在E.coli和动植物细胞中都有。能催化DNA中相邻的3`-OH和5`-P之间形成磷酸二脂键。
（用于共价连接DNA限制片段的连接酶有两种不同的来源：一种是由大肠杆菌染色体编码的叫做DNA连接酶。 另一种是由大肠杆菌T4噬菌体DNA编码的叫做T4DNA连接酶。）
核酸酶S1：从米曲霉中提纯得到的一种金属蛋白，是单链特异性核酸酶，能降解单链DNA或RNA
（用途：(1)分析RNA·DNA杂合结构；(2)除去DNA的单链末端，生成平端；
(3)切断双链DNA 的发夹结构。）
逆转录酶：以RNA为模板的DNA聚合酶，来源于鼠（MLV）和禽类（AMV）的反转录病毒。由两
条肽链组成，具有5?→3?聚合酶和RNaseH活性(P55）。
RNaseH： 作用于DNA-RNA杂交分子中的RNA链，用于cDNA文库建立时除去DNA链以便第二
条链cDNA链的合成。
DNA聚合酶：催化以DNA为模板合成DNA的反应.
特点: (1)以dNTPs作底物；(2)有模板存在；(3)有引物存在；(4)新链合成方向为5?—3?一分子的核苷酸的3?-位羟基与另一分子核苷酸的5?-位磷酸基通过脱水可形成3?,5?-磷酸二酯键，从而将两分子核苷酸连接起来。
DNA甲基化酶：同限制性内切酶具有完全相同的识别顺序，甲基化酶使识别顺序中的某个碱基
发生甲基化，保护DNA不被限制性内切酶切开。
1. dcm 和dam甲基化酶对限制酶的影响
1）抑制某些限制酶的活性，不管两种限制酶的识别顺序是完全重叠还是边界重叠 如：完全重叠 BclI—dam(GATC)；ScrFI—dcm(CCA/TGG) 边界重叠 ClaI--dam； Sau96I--dcm 2）不能抑制某些限制酶活性，不管两者的识别顺序为何种重叠 如：dam--BamHI，Sau3AI，BglII，PvuI； dcm--BstNI
限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并在相关位置切割
DNA双链结构的核酸内切酶。
核酸酶可分为核算外切酶和核酸内切酶
核酸外切酶：以核酸分子的末端为酶解部位逐个降解核苷酸 核酸内切酶：从核酸分子内部水解磷酸二酯键使之断裂成小片段
限制性酶的类别与活性 Ⅱ型酶 Ⅲ型酶 Ⅰ型酶 蛋白结构 内切酶亚基和甲基2亚基的双功3亚基的双功能酶 化酶亚基分开 能酶 识别位点 4～6bp序列 5～7bp 两侧对称或不对称 常为回文 不对称序列 剪切位点 在限制位点 限制位点上游 离限制位点 >1000 24～26bp处 bp的非特异位点 限同时存在 互相排斥 制与甲活性分开 基化
基因工程中最常用的是Ⅱ型酶
绝大多数Ⅱ型酶可以识别4-8个核苷酸的特异序列，这些序列可以是连续的也可以间断的。大多识别序列呈180。旋转对称或二重互补对称，也成回文结构。 限制酶识别序列的相邻序列效应（P48）：即大多数限制性内切酶对只含识别序列的寡核苷酸没有催化活性，需在两侧各延长一个或几个核苷酸才能被有效酶切 应用：设计引物时加保护碱基。
限制酶的位点偏爱性:限制性核酸酶的切割效率与酶切位点侧翼序列的核苷酸组成有关。 星活性是指某些限制性核酸内切酶在不适的环境中其识别序列发生改变的现象
第四章
载体：能携带外源基因导入受体细胞，这种运载工具称载体。
1.克隆载体: 具组装、复制、扩增功能。如：pBR322、pUC18/19等。
2.表达载体: 不仅具组装、复制、扩增功能，还有转录表达功能。如pBV220、pKK223-3 (按功能分) 3.载体的种类：质粒、噬菌体、柯斯质粒、单链DNA噬菌体、噬菌粒和人工染色体克隆载体 (按构
建克隆载体的DNA来源分)。
共同特征（或应具备的条件）： ①自主复制
②易于扩增分离纯化
③有单一酶切位点或多克隆位点：单一酶切位点：一种酶在一个载体上只有一个酶切位点
多克隆位点：一个载体上的某一个区域含有多个单一酶切位点
④有选择标记基因
⑤表达载体还应有表达调控元件（启动子、增强子、终止子,SD序列） ⑥具有较好的安全性，避免基因的非控制扩散
蓝白斑筛选：应用插入失活效应(P74)：
（插入失活法：外源DNA片段插入到载体的选择标记基因中使此基因失活,丧失其原有的表型特征）
1. α－互补：载体都携带一段细菌的lacZ基因，它编码β－半乳糖苷酶N-端的146个氨基酸，称为α－肽，载体转化的宿主细胞为lacZΔ15基因型，它表达β－半乳糖苷酶的C-端肽链，当载体与宿主细胞同时表达两个片段时，宿主细胞才有β－半乳糖苷酶活性，使特异的底物X-gal 在IPTG作用下变为蓝色化合物
2. 载体位于lacZ基因中靠近5?端增加一段MCS片段，插入MCS的外源DNA片段会阻断α－肽链的合成，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。