实验五 微生物的计数与活性污泥中生物相观察
一、 实验目的
1、学习平板菌落计数法的基本原理和方法，了解血球计数板的结构和使用方法和分光光度法计数法的原理和方法。 2、学会用血球计数板对芽殖酵母进行计算。
3、学习观察活性污泥中生物相的方法，初步分析生物处理系统工作状态是否正常。
二、 实验原理
1、 平板菌落计数法
平板菌落计数法是将待测样品经适当的稀释后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据稀释倍数和取样接种量即可算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不容易完全分散成单个细胞，所以长成的一个单个菌落也有可能来自样品中的2—3个或者更多细胞。因此平板菌落结果往往偏低。为了清楚阐述平板菌落计数结果，现在已倾向使用菌落形成单位，而不以绝对的菌落数来表示样品的活菌含量。 2、 分光光度法
当光线通过细菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量降低。在一定的范围内，菌细胞浓度与透光度成反比，与光密度成正比，而光密度或透光度可以由光电池精确测出。因此，可用一系列己知菌数的菌悬液测定光密度，作出光密度--菌数标准曲线。然后，以样品液所测得的光密度，从标准曲线中查出对应的菌数。制作标准曲线时，菌体计数可采用血球计数板计数，平板菌落计数或细胞干重测定等方法。 3、 血球计数板法
利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液（或孢子悬液）放在血球计数板和载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一
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定的（0.1mm3），所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是或菌体和死菌体的总和，故又称为总菌计数法。
血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有四个槽构成三个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各刻有一小方格网，每个方格网共分九个大方格，中央的一大方格作为计数用，称为计数区。计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个中方格（大方格用三线隔开），而每个中方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个中方格（中方格之间用双线分开），而每个中方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。 计数区边长为1mm，则计数区的面积为lmm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1/4000mm3。其构造如下图所示。
在计数时，通常数五个中方格的总菌数，然后求得每个中方格的平均值，再乘以16或者25，就得出一个大方格中的总菌数，再换算成1mL菌液中的总菌数。
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4、 活性污泥相观察
活性污泥中的生物相比较复杂，以细菌和原生动物为主，还有真菌、后生动物等。某些细菌能分泌胶粘物质形成菌胶团，进而组成污泥絮绒体（绒粒）。在正常的成熟污泥中，细菌大多集中于菌胶团絮绒体中，游离细菌较少，此时，污泥絮绒体可具有一定形状、结构稠密、扩光率强、沉降性能好。原生动物常作为污水净化指标；当固着型纤毛虫占优势时，一般认为污水处理池运行失常；当后生动物轮虫等大量出现时，意味着污泥极度衰老。
活性污泥的污泥絮粒大、边缘清淅、结构紧密,呈封闭状、具有良好的吸附和沉降性能。絮粒以菌胶团细菌为骨架,穿插生长一些丝状菌,但丝状菌数量远少于菌胶团细菌,未见游离细菌、微型动物以固着类纤毛虫为主,如钟虫、盖纤虫、累枝虫等;还可见到木盾纤虫在絮粒上爬动,偶尔还可看到少量的游动纤毛虫等,轮虫生长活跃。这是运行正常的污水处理设施的活性污泥生物相,表明污泥沉降及凝聚性能较好,它在二沉池能很快和彻底地进行泥水分离,处理出水效果好。在形成这种生物相结构时,应加强运行管理,以继续保持这种运行条件。 5、观察活性污泥生物相的意义。
活性污泥和生物膜是生物法处理废水的主体，污泥中微生物的生长、繁殖、代谢活动以及微生物之间的演替情况往往直接反映了处理状况。因此，我们在操作管理中除了利用物理、化学的手段来测定活性污泥的性质，还可借助于显微镜观察微生物的状况来判断废水处理的运行状况，以便及早发现异常状况，及时采取适当的对策，保证稳定运行，提高处理效果。为了监测微型动物演替变化状况还需要定时进行计数。
三、 实验方案（本实验只做血球计数板法和活性污泥生物相观察）
1、 实验仪器
显微镜，载玻片和盖玻片，酒精灯，无菌吸管，无菌试管，血球计数板，镊子及常用实验用品。 2、 实验材料
活性污泥溶液，芽殖酵母培养液。 3、 实验步骤
（1） 细菌计数（本实验用血球计数板法）
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①检查血球计数板：先用自来水冲洗血球计数板，然后擦干，在酒精灯上灼烧盖玻片灭菌除去脂质。盖上盖玻片夹在载物台上，先在低倍镜找到计数格，然后换40倍，调节光圈，载物台等，直到清晰观察到计数格子。看其是否沾有杂质或菌体，若有污物则需用脱脂棉蘸取95%乙醇轻轻檫洗计数板的计数室，再用蒸馏水冲洗，吸干其上的水分。
②加样。先将盖玻片放在计数室上，芽殖酵母菌悬液摇匀，用滴管吸取少许，从计数板中间平台两侧的沟槽内沿盖玻片的下边缘摘入一小滴（不宜过多），让菌悬液利用液体的表面张力充满计数区，勿使气泡产生，并用吸水纸吸去沟槽中流出的多余菌悬液。静置片刻，使细胞沉降到计数板上，不再随液体漂移。
③计数。将血球计数板放置于显微镜的载物台上夹稳，先在低倍镜下找到计数区后，再转换高倍镜观察并计数。由于活细胞的折光率和水的折光率相近，观察时应减弱光照的强度。
25个大方格组成的计数区，数左上、左下、右上、右下和中央的5个大方格（即80小格）血球计数板菌数。为了保证计数的准确性，避免重复计数和漏记，在计数时，对沉降在格线上的细胞的统计应有统一的规定。如菌体位于大方格的双线上，计数时则数上线不数下线，数左线不数右线，以减少误差。即位于本格上线和左线上的细胞计入本格，本格的下线和右线上的细胞按规定计入相应的格中。对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2--3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），取平均值，按公式计算出每mL菌悬液所含细胞数量。
酵母菌细胞数=80小格内酵母菌细胞80数?400?10?1000?稀释倍数
由于芽殖酵母浓度比较高，所以先稀释3倍，发现浓度还是太高，再稀释了10倍。所以总的稀释倍数为30。
测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻度。洗净后自行晾干，放入盒内保存。 （2） 平板菌落计数法
①编号。取无菌平皿9套，分别用记号笔标下10、10、10各三套，另取6支盛有9mL无菌水的试管，依次标明10、10、10、10、10、10。
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②稀释。用1mL无菌吸管，吸取已充分混匀的大肠杆菌菌悬液，放至标注10-1的试管中，吹吸三次，此即为10倍稀释，吹吸时不要太猛太快。然后换一支无菌吸管从10-1稀释液试管中吸取lmL菌液放进标注10-2的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10稀释液；以此类推，连续稀释，制成10、10、10、10-6等一系列稀释菌液。
③涂布。先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用3支无菌吸管分别吸取10-4、10-5、10-6的稀释菌液各0.2mL对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上(每个编号设三个重复)。用无菌涂棒或玻璃珠将稀释液均匀抹在平板表面。同一稀释液可用同一涂抹棒。反之，必须更换涂抹棒或灭菌后再用。将涂布好的平板平放于桌上几小时，待稀释液中的水分干后再将平板倒转，置于37℃恒温箱培养。
④计数。培养48h后取出培养平板，计算同一稀释度3个平板上的平均菌落数，并按下列公式进行计算。
cfu=M×N×5
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式中，cfu—每毫升中菌落形成单位；
M—同一稀释度3次重复的平均菌落数； N—稀释倍数。 （3） 分光光度法
①标准曲线制作
编号：取无菌试管7支，分别用记号笔将试管编号为l、2、3、4、5、6、7。 调整菌液浓度：用血细胞计数板计数培养24h的菌悬液，并用无菌生理盐水分别稀释调整为每毫升1×10、2×10、4×10、6×10、8×106、10×10、12×106个菌数的细胞悬液。再分别装入己编好号的1至7号无菌试管中。
测OD值：将1至7号不同浓度的菌悬液摇均匀后于560nm波长、1cm比色皿中测定OD值。比色测定时，用无菌生理盐水作空白对照，并记录OD值。
绘制标准曲线：以光密度(OD)值为纵坐标，以每毫升细胞数为横坐标，绘制标准曲线。
②样品测定
将待测样品用无菌生理盐水适当稀释，摇匀后，用560nm波长、1cm比色
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