胞相互融合的细胞在体外培养因无法增殖会渐渐死去。使用抗原结合法对杂交瘤细胞产生的抗体专一性进行筛选采用有限稀释法或软琼脂法对杂交瘤细胞进行细胞克隆化，获得来自单个细胞的克隆；并对单个细胞生长出的群落，再次以 ELISA 筛选专一性抗体，获得可产生特异性抗体的单克隆细胞株。用体内法大量制备单克隆抗体：可把筛选出来的杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，诱导小鼠产生大量腹水，然后以针头收集所产生的腹水，通常每次可取得3～5 mL左右。 4.HAT的选择原理是什么？
答：HAT系统为次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶核苷(T)的缩写。它是根据嘌呤和嘧啶生物合成途径设计的分离杂种细胞特殊的培养基。细胞内核苷酸的生物合成有两条途径：一条是主要途径，该途径中叶酸及其衍生物是必不可少的，氨基喋呤可抑制二氢叶酸还原酶活性，从而阻断细胞中DNA的合成；另外一条是补救途径，该途径需要两种酶参与。一种是HGPRT酶(次黄嘌呤磷酸核糖转移酶) ，另一种酶是TK酶(胸腺嘧啶核苷激酶) 。它们可以分别利用次黄嘌呤催化产生的肌苷酸及胸腺嘧啶核苷催化产生的脱氧胸苷来合成DNA。 H、T为应急途径时提供外源核苷酸“前体”。在氨基喋呤存在时，阻断了核苷酸的从头合成IMP的途径，细胞只能通过HGPRT使次黄嘌呤酸化形成次黄苷酸，再依次转化为AMP及GMP，即通过“补救途径”依赖外源来合成核苷酸。因此，一个HGPRT－或TK－的细胞株不可能在含HAT的培养液中生长。但这样的细胞与能提供HGPRT或TK酶的细胞相融合，则杂交细胞能在含HAT培养液中存活下来。如果融合细胞的亲本之一是一个能在体外长期生存的骨髓瘤细胞系，而另一个亲本细胞是体外增殖能力有限的正常细胞。如将长期培养系突变为HGPRT或TK酶缺陷型的细胞系，在和正常细胞融合后，未经融合或自身融合的骨髓瘤细胞在HAT培养液中死亡；未融合或自身融合的正常细胞在体外生存能力有限最终也死亡。因此存活下来的只有融合细胞。
5.利用细胞工程制备人源性单克隆抗体的方法主要有哪些？它们的优势与难点何在？
答：主要有：EB病毒转化技术，人－鼠杂交瘤单克隆抗体，人－人杂交瘤单克隆抗体，利用基因组工程构建转人Ig基因组小鼠，严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体。 优势和难点：
1、利用类似于疱疹病毒的EB病毒在体外直接感染人外周血淋巴细胞，使之转化获得永生能力得到人B淋巴细胞系，这些细胞可在体外分泌人抗体。
2、人－鼠杂交瘤的单克隆抗体分泌性能不稳定，多数情况下由于人染色体的丢失导致杂交瘤细胞失去分泌抗体的能力。
3、人－人杂交瘤单克隆抗体可供利用的人骨髓瘤细胞种类非常有限，人的骨髓瘤细胞在融合率、非分泌型方面仍不及小鼠骨髓瘤细胞，而且人不能像小鼠那样进行高度免疫，B淋巴细胞常限于取自外周血(小鼠取自动物脾脏)，激活状态不适合做融合；故人－人杂交瘤细胞在融合、融合后的筛选以及融合细胞分泌抗体方面仍不理想。
4、基因组工程构建转人Ig基因组小鼠：改造过的抗体除了构成抗原识别与抗原结合部位的三个互补决定区(CDR)是鼠源的以外，其余部分均是人源的。以后仅需免疫小鼠制作单克隆抗体，但获得的是人抗体而非小鼠抗体。该技术难度较大，但已有成功的报道。
5、严重免疫缺陷小鼠制备人单克隆抗体：将人免疫干细胞移植到SCID小鼠体内，SCID小鼠获得了人的免疫系统。这种小鼠可用任何抗原免疫，从激活的淋巴细胞中富集抗原特异性人源性B淋巴细胞，进一步进行细胞融合或制备抗体库 6.简述单克隆抗体在临床诊疗中的应用。
答：理论研究，构建B淋巴细胞杂交瘤可用于分析B细胞的多样性及其产生机理，并能分析免疫应答中抗体的多样性。利用单克隆抗体可进行表位分析：利用单克隆抗体的交叉反应，能帮助找出大分子之间在重要结构和生物学上的关系，因为对一种单克隆抗体起反应的几种大分子一定具有相同和相似的抗原决定簇。
诊断试剂中的应用，针对HIV、乙肝等疾病的单克隆抗体，测定妊娠的hCG单克隆抗体、测定排卵的LH单克隆抗体在市场上大量供应。
疾病治疗上的应用， 单克隆抗体有可能作为体内应用的单克隆靶向制剂的载体。
第四章 哺乳动物胚胎工程
1.什么是胚胎工程？其主要内容包括哪些？
答：胚胎工程 (embryonic engineering) 是指对配子或胚胎进行人为地干预，使其环境因素、发育模式或局部组织功能发生量和质的改变。与基因工程、细胞工程、蛋白质工程等一样，是生物工程的一个分支。研究的对象主要是雌雄配子（卵和精子）以及早期胚胎。
其主要内容包括：体外受精技术，胚胎移植技术，胚胎分割技术，早期胚胎体外培养技术，胚胎冷冻保存技术，动物性别控制技术。
2.什么是体外受精技术？它与人工授精技术有何不同？
答：体外受精( IVF)是指在体内或体外成熟的卵母细胞同体内或体外获能的精子，在体外环境中完成其受精的技术过程，受精卵经体内或体外培养、移植后妊娠产仔。由于精卵结合的受精过程是在实验室进行的，故又称为“试管动物” (test tube animal)。包括：卵母细胞的采集、卵母细胞的体外成熟、精子的获能处理、体外受精、受精卵的体外培养、胚胎移植。
人工授精 (AI)也称为人工输精，是指通过人为的方法将动物（或人）的新鲜或冷冻精液输入到雌性动物（或人）的生殖道内，使之受孕，以代替自然交配过程。 3.简述胚胎移植技术的原理与一些关键技术的特点。
答：胚胎移植(embryo transfer, ET)是指一头（只）雌性动物（供体）发情排卵并经配种后，在一定
时间内从其生殖道（子宫或输卵管）取出胚胎；或者是由体外受精获得的胚胎，然后把这些胚胎移植到另外一头与供体同期发情，但未经配种的受体动物生殖道的相应部位（子宫或输卵管），外来胚胎在受体子宫着床并继续生长发育，最后出生供体的后代，即通常所说的“借腹怀胎”。 胚胎移植技术主要技术环节：供体动物的超数排卵，供体、受体动物的同步发情，供体母畜的配种或人工授精（人工输精），胚胎的采集（包括手术回收和非手术回收），胚胎的检查与质量鉴定，胚胎移植（包括手术移植和非手术移植），受体动物的观察和饲养管理 4.胚胎分割和胚胎嵌合技术有何不同，这些技术的原理是什么？
答：胚胎分割是哺乳动物胚胎工程的重要组成部分。胚胎分割就是将一枚胚胎通过显微操作的方法分割为二、四或八，经体内或体外培养，然后移植入受体，以获得同卵双胎或同卵多胎后代。也即把一枚胚胎无性繁殖为多枚，是最简单的动物克隆方法。嵌合体技术在胚胎工程领域中，是指由两枚或两枚以上的胚胎（同种或异种动物）的全部或部分细胞聚合在一起，使之构成一个新的胚胎，并将胚胎移植到受体动物让其继续发育形成一个嵌合体后代的技术，出生的动物具有亲本动物的全部或部分性状。
胚胎分割主要方法：A. 显微操作仪分隔法；B. 徒手分割法 嵌合体制作方法：
A.卵裂球（胚胎）聚合法：该法是用两枚或两枚以上发育阶段相同或不同的胚胎卵裂球（或 胚胎）相聚合培育嵌合体个体。该方法要求相互聚合的胚胎发育时期不能相差太远，ES 细胞无法用该方法得到嵌合体。
B. 细胞注入法：该法是用显微操作的方法将供胚细胞或内细胞团注入受体胚的囊胚腔内发 育成嵌合体。该方法操作繁琐但效率高，可以用于发育时期相差甚远的胚胎和ES细胞制作嵌 合体。该方法可以用来定向制作由不同来源的ICM和滋养外胚层细胞够成的嵌合胚。 5. 制备嵌合体动物的主要技术方法有哪些？试述其主要技术过程。 答：嵌合体制作方法：
A. 卵裂球（胚胎）聚合法：该法是用两枚或两枚以上发育阶段相同或不同的胚胎卵裂球（或胚胎）相聚合培育嵌合体个体。该方法要求相互聚合的胚胎发育时期不能相差太远，ES细胞无法用该方法得到嵌合体。
B. 细胞注入法：该法是用显微操作的方法将供胚细胞或内细胞团注入受体胚的囊胚腔内发育成嵌合体。该方法操作繁琐但效率高，可以用于发育时期相差甚远的胚胎和ES细胞制作嵌合体。该方法可以用来定向制作由不同来源的ICM和滋养外胚层细胞够成的嵌合胚。主要有ICM注入法和ICM重组法两种。(1) ICM注入法——通过显微操作将供体胚的内细胞团(ICM) 或分离的ICM的单个细胞注入受体的囊胚腔，以此培育成嵌合体个体。(2) ICM重组法——为了解ICM的发育分化潜力及其影响因素，采用从受体囊胚中去掉原有的ICM，移入新的ICM，称为囊胚重组
(Reconstitution of blastocyst)，或称ICM置换 (ICM exchange)。
6、胚胎培养中：血清——是胚胎培养中添加的主要蛋白质，在保持细胞的存活、促进生长、维持细胞pH及渗透压的稳定、增加细胞弹性及膜的完整性方面都有重要作用。牛血清白蛋白是培养液中常添加的一种蛋白源物质，牛血清白蛋白能结合培养液中的一些胚胎毒性物质，对胚胎有保护作用。
7、 卵母细胞和胚胎的冷冻保存，广义讲，就是设法在体外或体内把卵母细胞或胚胎暂时贮存起来而不使其失去活力。狭义讲，卵母细胞和胚胎保存是指把卵母细胞和胚胎放在低于正常发育温度下，使细胞的新陈代谢和分裂速度减慢，甚至完全停止，使其处于暂时停顿状态；一旦恢复到正常发育温度时，卵母细胞和胚胎又能继续发育下去。
8、卵母细胞和胚胎的超低温冷冻保存主要有四种方法：慢速冷冻、快速冷冻、一步冷冻和玻璃化冷冻。
9、 胚胎冷冻效果的鉴定：形态学鉴定、染色鉴定、培养鉴定、移植鉴定。
10、卵母细胞和胚胎冷冻保存的意义：1、保存种资资源，对珍稀、濒危动物的保护具有重要意义；2、促进胚胎移植的应用与推广，使胚胎移植可以在任何时间、任何地点进行3、实现了胚胎的远距离运输，解决了活体大家畜引种的困难，同时减少了疾病的传播，促进了国际间良种的交换；4、卵母细胞的冷冻保存为体外受精、核移植、基因转移等技术的研究提供了充足的卵母细胞，促进这些技术的发展。
第五章 干细胞与组织工程课后习题答案
1. 依据细胞的分化潜能干细胞可分为哪几种类型？各类干细胞有何特性。
答：依据干细胞的分化潜能，可分为三种类型：全能性干细胞 (Totipotency Stem Cells)、多能性干
细胞 (Multipotency Stem Cells)、单能干细胞 (Monopotency Stem Cells) 。
全能性干细胞具有形成完整个体的分化潜能；多能性干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能，但却失去了发育成完整个体的能力，发育潜能受到一定的限制；单能（定向）干细胞（也称专能或偏能干细胞），这类干细胞只能向一种类型或密切相关的两种类型的细胞分化，多数的组织或器官干细胞属于这一类。
2. 什么是胚胎干细胞？常用的胚胎干细胞分离方法有哪些？
答：胚胎干细胞 (Embryonic stem cell)是指受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团(Inner Cell Mass) 的细胞经分裂培养，即得到胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我复制（或更新）并具有
分化为体内所有组织的能力。它是一种高度未分化细胞，具有发育的全能性，能分化出成体动 物的所有组织和器官，包括生殖细胞。包括畸胎瘤细胞 (teratocarcinoma cells, EC)胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES)原始生殖细胞 (primordial germ cells, PGC或EG)。
常用的胚胎干细胞分离方法有： A. 来源于早期胚胎的内细胞团；B. 从原始生殖嵴分离培养；C. 利
用体细胞核移植的方法建立；D. 利用细胞融合方法；E. 利用单个卵裂球制备胚胎干细胞；F. 来源于孤雌生殖胚胎；G. 利用基因转移技术从成纤维细胞诱导产生。 3. 胚胎干细胞有何特性，如何验证胚胎干细胞的全能性？
答：胚胎干细胞具有全能性，可以自我复制（或更新）并具有分化为体内所有组织的能力。胚胎干 细胞的鉴定：
①形态学检测：细胞呈圆形、核大、胞浆少；细胞排列紧密，呈集落形生长；集落常呈岛状、巢状。
②遗传学检测：为正常的二倍体核型；
③酶活性检测：ES细胞内端粒酶和碱性磷酸酶活性高；
④细胞表面标志物检测：ES细胞膜表面有特殊的标记：如， OCT-4， SSEA-3, SSEA-4等； ⑤体内分化潜能： 植入裸鼠皮下，可诱发形成畸胎瘤；可分化为三个胚层的细胞；能参与嵌合体的形成；
⑥体外分化潜能：可形成类胚体，可在体外诱导分化为三个胚层的细胞。 4. 什么是成体干细胞的可塑性？成体干细胞的可塑性有何用途？
答：来源于各种组织的成体干细胞事实上并未定型，它们的分化潜能远较先前所认为的要宽，一旦 处于一个新的微环境中，它们将有可能分化为其它类型的细胞；干细胞生物学家们将这种现象称为 成体干细胞的“可塑性” (plasticity)，也有人称为干细胞的“横向分化”或“跨系分化” (transdifferentiation)。
成体干细胞的可塑性给干细胞生物学的研究注入了新的活力。与胚胎性干细胞相比，它避开了胚胎干细胞研究所面临得伦理道德问题，吸引了更多的人力和财力，有关它的研究报道也日益增多。
第六章 核移植与动物克隆
1.简述细胞核移植技术的主要类型及其主要操作技术。
答：细胞核移植(nuclear transfer 或nuclear transplantation)是指通过显微操作的方法，将供体细胞的细胞核放入预先去核的成熟卵母细胞或早期合子内，形成一个新的核质重组体，移入的核在受体胞质的作用下，发生发育程序重编 (reprogramming)，使得核质重组体与正常受精卵一样，经细胞分裂、分化并在母体内发育成一个新的个体。
依据供体细胞类型分为：胚胎细胞核移植、胚胎干细胞核移植、体细胞核移植；依据供体细胞与受体卵母细胞的来源分为：同种核移植、种间核移植 。
主要操作技术：1. 受体卵母细胞的准备：超数排卵、活体采卵、屠宰后母畜卵巢上采卵（体外成熟）2. 供体细胞的准备：16-32 期胚胎、供体卵裂球。3. 卵母细胞的去核与注射4. 重组胚的融合：构建的重组体用直流电脉冲进行电融合5. 重组胚的激活：电激活、乙醇激活、钙离子和钙离子载