体激活、离子霉素(ionomycin)激活、Sr2+ 激活6. 重组胚的培养与胚胎移植。 2.讨论核移植技术的应用现状及其发展前景？
答:1. 体细胞克隆在生产转基因动物和医学领域的应用;2. 体细胞克隆技术在农业生产中的应用;3. 商业性克隆动物;4. 体细胞克隆在珍稀、濒危动物保护中的应用;5. 体细胞克隆在人类再生医学上的应用;6. 体细胞克隆在基础研究中的应用 3.分析影响动物核移植成败的关键因素。
答：影响体细胞核移植成功率的因素有：供体细胞的因素；受体卵母细胞的因素；核移植方 法的影响；激活方法的影响；体外培养系统的影响；受体动物管理及胚胎移植的影响；新生 动物护理及管理的影响。
第七章 基因转导与转基因动物
1、什么是转基因动物？
答： 转基因动物 (trnasgenic animal)：是指借用基因工程技术将外源基因导入动物染色体内，使外源基因与动物基因整合后随细胞的分裂而扩增，在动物体内表达并能稳定地遗传给后代的动物。生产转基因动物的方法主要有原核(显微)注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体导入法、细胞核移植法等，应用较多的方法为原核（显微）注射法。
2、制备转基因动物有哪些主要方法？简述其主要原理和技术过程。试比较这些方法的优劣。 答：主要有：生产转基因动物的方法主要有原核(显微)注射法、逆转录病毒感染法、胚胎干细胞介导法、精子载体导入法、细胞核移植法等，应用较多的方法为原核（显微）注射法。
显微注射法：基本原理——通过显微注射仪将外源基因直接注射到受精卵的雄原核内，使使外源基因整合到DNA中，发育成转基因动物。步骤：①目的基因的制备与纯化；②卵供体母体和假孕母体的准备；③超排卵与取卵；④基因显微注射；⑤受精卵移植；⑥目的基因的表达整合鉴定和检测；⑦建系。优点：外源DNA分子大小基本不受限制，外源DNA在宿主动物染色体上整合率高，方法相对简单，导入直观。但利用DNA显微注射法得到的转基因动物都是随机整合的，用该方法很难得到同源重组动物。
逆转录病毒法；P144 胚胎干细胞转导法；P145 精子载体法；P145 细胞核移植法P145
3、追踪转基因动物研究的发展，并预测其应用前景。
答： 自1981年，第一次成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因的动物技术。1982年获得转基因小鼠。转入大鼠的生长激素基因，使小鼠体重为正常个体的二倍，因而被称为\超级小鼠\。以后相继在10年间报道过转基因兔、绵羊、猪、鱼、昆虫、牛、鸡、山羊、大鼠等转基因动物的成功。由于转基因动物体系打破了自然繁殖中的种间隔离，使基因能在种系关系很远的机体间流动，它将对整个生命科学产生全局性影响。因此转基因动物技术在1991年第一次国际基因定位会议上
被公认是遗传学中继连锁分析、体细胞遗传和基因克隆之后的第四代技术，被列为生物学发展史上126年中第14个转折点。
应用前景：改良动物的性状，培育新品种制作“生物反应器”，生产医用蛋白基因治疗和建立人类疾病的动物模型，生产人类器官移植的代用品，基因治疗，基础理论研究中的应用(1). 基因表达与调控研究(2). 基因功能的研究
5、动物克隆技术于转基因技术结合将发挥哪些特殊的优势？
6、简述主要胚胎工程技术间的联系。
7、简述近年来动物细胞工程方面的重大研究进展，说明其意义何在？
第八章 动物染色体工程
1、什么是染色体工程？动物染色体工程主要包括哪些内容？
答：染色体工程(chromosome engineering)是人们按照一定的设计，有计划地应用染色体组合并、单条染色体或染色体片段的附加、代换、消除和易位等技术，实施对生物的染色体组或染色体结构进行改造，从而达到定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。动物染色体工程主要包括：人工诱导多倍体，指每个体细胞中含有三个或更多染色体组的个体而言。由于多倍体动物具有生长速度快，成活率高及抗病能力强等特点，所以人工诱导多倍体、改善动物经济性状倍受重视。雌核发育，是单性生殖的一种，指卵子依靠自己的细胞核发育成个体的生殖行为。雄核发育，是指通过物理和化学等方法破坏卵核的遗传物质，使其失去活性，依靠精子核发育成胚胎的生殖方式。人工染色体，基于ARS、CEN、TEL是线性染色体稳定的功能序列，人们利用这些序列构建载体，重组后的DNA以线性状态存在，这样不仅稳定，而且大大提高了插入外源基因的能力，并且可以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传，称为人工染色体，包括：酵母人工染色体，细菌人工染色体， 哺乳类人工染色体。
2、动物染色体加倍技术主要有哪些？比较它们各自的特点及其适用对象。（P157）
答：化学方法：秋水仙碱：可以抑制细胞分裂中纺缍丝的形成，因而抑制有丝分裂。细胞松驰素B：能抑制肌动蛋白聚合成微丝，从而抑制细胞的胞质分裂。其它药物：麻醉剂N2O 、聚乙二醇等。物理学方法：温度休克法——包括冷休克法和热休克法两种，即用略低于或略高于致死温度的冷或热休克来诱导三倍体或四倍体的方法。此法廉价、易操作，是诱导动物细胞多倍体化的常用手段，也有利于养殖场大规模生产使用。一般来说，冷水鱼类（如鲑科）应用热休克法，而温水鱼类用冷休克效果好。静水压法——就是采用较高的静水压（65kg/cm2）来抑制第二极体的排出或第一次卵裂产生多倍体。此种方法诱导率高（90%~100%）、处理时间短（3~5min），对受精卵损伤小、成活
率高。但该法需要专门的设备——水压机，成本较高，其样品室容量有限，处理卵的量有限，所以不适于大规模生产。生物学方法：Rasch等(1965) 年首次证明了三倍体脊椎动物可以通过杂交产生，他们将雌核发育的二倍体帆鱂(Poecilia formosa)与P. Vittate杂交，得到三倍体后裔。雌性草鱼(2n=48)与雄性三角鲂( 2n=48)杂交获得子一代染色体数目为72的草鲂杂种三倍体，其中草鱼提供了二倍数目的染色体(48)，三角鲂提供了单倍数目的染色体(24)。异育银鲫与兴国红鲤杂交获得的复合四倍体，通过细胞方法证明其产生的原因是受精卵发生了两性融合。
3、简述多倍体育种的鉴定方法。
答：(1) 直接法：染色体计数：鉴定多倍性的最准确、最直接方法DNA含量测定：流式细胞仪 (2) 间接法：核体积测量：二倍体/三倍体核体积之比为1:1.5，二倍体与四倍体的核体积之比为1:1.74。蛋白质电泳：生化分析：如在关东银鲫中，三倍体红血球的丙酮酸激酶的含量含著高于二倍体，比率为1.68；己糖激酶与磷酸果糖激酶活性也较高，比率为1.26和1.35。
4、比较几种人工诱导雌核发育方法的原理及其特点。（P160） 答：一,精子遗传物质的失活： 物理方法：
X射线和紫外线等处理，诱使精子染色体断裂，使精子的遗传
物质失活。
化学方法：采用化学物质如甲苯胺蓝、乙烯尿素和二甲基硫酸等消除精子染色体遗传活性的方法。 显微手术法：采用显微操作，直接去除受精卵中雄性原核并诱导雌原核加倍形成二倍体。
二，细胞分裂的阻止：人工诱导雌核发育除使精子遗传物质失活外，还必须解决雌核染色体二倍化的问题。保留受精卵第二极体或阻碍受精卵早期有丝分裂，是解决二倍体化常见的两种途径。常用温度休克法（冷休克和热休克）、流体静水压法和化学试剂处理（如细胞松驰素B）来阻止极体的排出或有丝分裂，以达到雌核染色体二倍体化目的。 5、何为人工染色体？它的主要构成元件是什么？
答：基于ARS、CEN、TEL是线性染色体稳定的功能序列，人们利用这些序列构建载体，重组后的DNA以线性状态存在，这样不仅稳定，而且大大提高了插入外源基因的能力，并且可以像天然染色体一样在寄主细胞中稳定复制和遗传，称为人工染色体。主要构成元件是：自主复制DNA序列、着丝点DNA序列、端粒DNA序列。
6、酵母人工染色体如何构建？它在基因组研究中发挥了何种作用？
答：酵母人工染色体的构建包括：大片段DNA的获取、YAC重组体的构建、YAC重组体对酵母的转化、YAC基因库的鉴定、目的基因YAC克隆的筛选、目的基因YAC克隆的鉴定。