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3.1.3实验试剂及其配制 ......................................................................................................................................................................................................................... 25 3.2錢旅 ............................................................................................................................................................................................................................................................................................. 25
3.2.1材料处理 ......................................................................................................................................................................................................................................................... 25 3.2.2半夏的种植 ................................................................................................................................................................................................................................................ 25 3.2.3半夏不同生长时期样品采集及处理 ............................................................................................................................................................. 26 3.2.4半夏总蛋S的提取 ........................................................................................................................................................................................................................ 26 3.2.5不同生长时期半夏总蛋白的SDS-PAGE电泳检测 ............................................................................................................... 26 3.2.6不同生长时期半夏总蛋白的含量测定 ..................................................................................................................................................... 26 3.3结果与分杴 .................................................................................................................................................................................................................................................................... 26
3.3.1半夏不同生长时期采集的样品 .............................................................................................................................................................................. 26 3.3.2不同生长时期半夏总蛋白的SDS-PAGE电泳检测结果 ............................................................................................... 27 3.3.3不同生长时期半夏总蛋白的含量测定结果 .................................................................................................................................... 29 3.4讨论与小结 .................................................................................................................................................................................................................................................................... 32 第四章半夏蛋白对Hela细胞作用的研究 .............................................................................................................................................................................................. 3
4.1实验材料、器材与试剂 ............................................................................................................................................................................................................................. 3
4.1.1实验材料 ............................................................................................................................................................................................................................................................ 3 4.1.2实验器材 ............................................................................................................................................................................................................................................................ 3 4.1.3实验试剂及其配制 .......................................................................................................................................................................................................................... 3 4.2 錢:?? ............................................................................................................................................................................................................................................................................................ 3
4.2.1半夏凝集素单体的制备 .......................................................................................................................................................................................................... 3 4.2.2 Hela细胞培养 ...................................................................................................................................................................................................................................... 3 4.2.3细胞增殖抑制实验(MTT法) ......................................................................................................................................................................................... 36 4.2.4倒置相差显微镜摄影 ............................................................................................................................................ . ................................................................ 36 4.3结果与分杴 .................................................................................................................................................................................................................................................................... 37
4.3.1半夏凝集素单体SDS-PAGE凝胶检测 ......................................................................................................................................................... 37 4.3.2细胞增殖抑制实验分杴 ....................................................................................................................................................................................................... 38 4.3.3细胞形态分杴 ........................................................................................................................................................................................................................................ 40 4,4讨论与小结 ..................................................................................................................................................... .................................... ...................................................................... 41 总结与展望.............................................................................................................................................................................................................................................................................................. 43
.................................................................................................................................................................................................................................................................. . ................................. 45
致谢 ......................................... .......... . ......................................................................... ............ — ................ .................................................... ........................ . ........................................ ................. 52 附录I:重要溶液配制 ............................................................................................................................................................................................................................................................. 53 附录2:攻读硕士学位期间的研究成果 ................................................................................................................................................................................................. 55
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略语表
m APS AFLP ddHzO EDTA FBS HPLC ISSR
中文全称 过硫酸按 扩增片段长度多态性技术 双蒸水 乙二胺四乙酸 胎牛血清 高效液相色谱
简单序列重复区间扩增多态性 技术 睡哩蓝 磷酸盐缓冲液
英文全称 Ammonium persulfate Amplled fragment length polymorphism Double distilled Water Ethylene diameminetetraacetic acid Fetal bovine serum
High performance liquid chromatography
Inter-simple sequence repeat polymerphisms
MTT PBS
Thiazolyl blue tetrazolium bromide
Phosphate buffered saline
PCR-RFLP 多聚酶链反应-限制性片段长 Polymerase chain reaction restriction
度多态性. fragment length polymorphism Phytohem agglutinin Pinellia temata lectin
PHA PTL RAPD SDS
植物凝集素 半夏凝集素
随机扩增DNA多态性技术 十二综基硫酸纳
Random amplified polymorphic DNA Sodium dodecyl sulfate
SDS-PAGE 十二综基硫酸纳-聚丙炼醜胺 Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
凝胶电泳 electrophoresis
Sequence-related amplified polymorphism N,N,KjN-Ietramethylethylenediamine Thin-layer chromatography
SRAP
TEMED TLC
相关序列扩增多态性技术
N,N,N',N'-四甲基乙二胺 薄层色谱
VIII
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第一章文献综述
1.1 半*
半MXPineUici ?em?m(Thunb.)Breit.)为天南星科半夏属多年生草本植物，又名三叶半 夏、半
月莲、三步跳、孚田、水玉、羊服等，以千燥块莲入药，性温、味辛、有毒。半夏 是我国中药宝库中一味重要的药材，也是我国重要的出口产品>，在我国已有2000多年的 用药历史。据统计，在558种中药处方中，半夏使用频率居第22位。半夏有水生和陆生 两种，即水半夏和旱半夏(图1.1),旱半夏的药用价值强于水半夏。由于半夏资源日益减少 或因部分地区药用习惯，各地至少有同科3属11种植物充作半夏使用，如水半夏、掌叶半 夏、狗爪半夏等，不少地区在应用中以水半夏等代用。
[】
a:旱半夏；b:水丰夏 Fig. 1,1 Pinellia Tuber and Rhizoma Typhonii Flagelliforinis
i.u半10?1糊及分布
半夏属植物在分类学上属于天南星科南星亚科，该属含9种植物，中国目前发现的有 7种，分
别为石蝴蛛滴水珠半夏(/^corc/flto)、盾叶半夏(/^/?g/,ato)、三叶半夏
r: 圓1.1早半JDm水半Jt
a: Pinellia Tuber; b: Rhizoma Typhonii FlageIIiformis
I Jf _If ^,1
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(Rtemata)^ 掌叶半夏三裂叶半夏及大半夏CP;w(vgft_y//fl),其中 6
种为中国特有。我国半夏资源十分丰富，资料显示除内蒙古、青海、西藏、新疆外，我国 其它省市地区均有分布，主要产于辽宁、陕西、湖北、山东、山西、四川、河南、安徽、 甘肃、江苏、浙江等地区，可能多由历史发展起来的。天南星科南星亚科半夏属在我国主 要种如下所示(表U)。
表U夭南星科半K厲在我国的主要种 Table 1.1 The species of PineIIia Ten. of Araceae in China
种名 种拉丁名 别名 分布情况 石觸妹
Rintegrifolia 一面银、白铃子(四川叙 我国特有，散布于湖北宜昌、四川 永）
的叙永和重庆
一滴珠、蛇珠、石半夏、 我国特有，产安徽、浙江、江西、
RcordcUa
滴水珠半夏
水半夏、制蛇子、岩孙、 福建、湖北、湖南、广东、广西、 心叶半夏、独龙珠等 责州，海拔800 m以下
我国特有，产浙江文成、庆元、乐
无
清、雁荡山及福建杳政等地,在《澳 危植物红皮书》中被列为颜危E级
盾叶半夏
Rpeltata
三步跳、洋舉买、老鸭 除内蒙古、新疆、青海、西藏尚未
Rtemata
三叶半夏
眼、燕子尾、地慈姑、 发现野生的外，全国各地广布，
朝
球半夏、和姑、孚田等 鲜、曰本也有
掌叶半夏、绿孙子、天 我国特有，分布于北京、河北、山
虎掌
Rpedatisecta 南星、狗爪半夏、半夏 西、陕西、山东、江苏、上海、安 子、真半夏、大三步跳、 徽、浙江、福建、河南、湖北、湖 南星等
南、广西、四川、责州及云南北部
1.1.2半夏的形态特征
天南星科半夏属植物属多年生草本植物，具块莲，不同种半夏形态特征稍有差异，如 石蝴蛛叶片全缘、滴水珠叶片长三角形、盾叶丰夏叶片盾状、三叶半夏叶片3全裂、虎
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掌 叶片鸟足状分裂等。半夏属不同种的形态特征如表1.2及图1.2所示。