温度对鲜切苹果多酚氧化酶活性影响的研究
孙荣
(生物与食品工程学院12级食品质量与安全班)
指导老师:陈军
摘要：以姬娜苹果、青蛇果、红蛇果、家优鲜红富士、金帅苹果五个品种为实验材料，采用分光光度法以邻苯二酚为底物，分别在0℃，4℃，8℃，20℃，25℃条件下贮藏不同时间的鲜切苹果的多酚氧化酶活性进行了测定。结果表明：在不同温度贮藏下不同品种鲜切苹果多酚氧化酶变化趋势大致相同，呈现先上升后下降的变化趋势；其中不同品种鲜切苹果在20℃和25℃贮藏条件下多酚氧化酶的活性较高，而在4℃贮藏条件下其多酚氧化酶的活性最低。鲜切红蛇果的多酚氧化酶活性最高，而鲜切姬娜苹果，鲜切家优鲜红富士苹果，鲜切青蛇果，鲜切金帅苹果的多酚氧化酶活性均小于鲜切红蛇果。 关键词：鲜切苹果；温度；多酚氧化酶
引言
鲜切苹果是指新鲜苹果经分级、清洗、整修、去皮、切分、保鲜、包装等处理后, 供消费者立即食用或餐饮业使用的一种新型苹果加工产品。它具有新鲜、方便、卫生等优点,在欧美及日本等地已经形成了巨大的消费市场,同时在我国也开始占到一定市场份额, 并在快速增长。但是，鲜切苹果加工过程中造成的机械损伤会使苹果天然的组织结构遭到破坏,膜透性增加,酚类物质和多酚氧化酶(PPO)迅速接触而导致果实发生酶促褐变[1-4] ,在氧化酶作用下酚类物质氧化形成醌类物质,醌类物质再自我聚合形成类黑色素，从而导致产品变色的现象[5] 。低温贮藏可直接抑制酶的活力,减慢褐变反应的速度和强度,是抑制果蔬褐变最直接有效的方法，且简单易行、安全性高。目前国内外普遍将低温贮藏作为鲜切果蔬保鲜的基本手段[6-7]。一般研究认为5 ℃左右适宜贮藏鲜切果蔬而不发生冷害[8] 。本实验选取了不同品种的苹果，分别在0℃、4℃、8℃、20℃、25℃条件下贮存不同的时间，采用了分光光度法对其活性进行测定。本论文主要研究温度对鲜切苹果贮存期间多酚氧化酶的影响,从而找到鲜切苹果适合的贮藏温度，为日后苹果的鲜切加工、保鲜过程中防酶促褐变提供一些参考。
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1 材料与方法
1.1 材料与仪器 1.1.1 实验材料
姬娜苹果、青蛇果、红蛇果、家优鲜红富士苹果、金帅。购于宿州市家乐福超市和华夏超市。 1.1.2 实验器材
FA2004N型电子天平（上海精密科学仪器有限公司）、722G型可见分光光度计（上海仪电分析仪器有限公司）、离心机（湖南仪器仪表总厂离心机厂）、SHP-250型生化培养箱（上海三发科学仪器有限公司）、BCD-198(KK20V0060W)可控温冰箱、匀浆机（奥克斯集团有限公司）、烧杯、玻璃棒、胶头滴管、试管架、移液管、1000mL容量瓶、500mL容量瓶、50 mL容量瓶、量筒、胶头滴管、水果刀。
1.2 试剂及溶液配制 1.2.1 试剂
十二水合磷酸氢二钠（分析纯AR）、柠檬酸(分析纯AR)、邻苯二酚（化学纯CP）、蒸馏水。 1.2.2 溶液配制
(1) 0.2mol/LNa2HPO·12H2O溶液
精确称取71.628g十二水合磷酸氢二钠晶体加蒸馏水，用玻璃棒搅拌，直到完全溶解，用玻璃棒引流倒入容量瓶中，再用蒸馏水润洗三到四次，最后用胶头滴管定容到1L，倒置摇匀。溶液待用。
(2) 0.1mol/L柠檬酸溶液
精确称取10.507g柠檬酸晶体加蒸馏水，用玻璃棒搅拌，直到完全溶解，用玻璃棒引流倒入容量瓶中，再用蒸馏水润洗三到四次，最后用胶头滴管定容到500mL，倒置摇匀。溶液待用。
(3) 0.2mol/LpH6.8柠檬酸-磷酸缓冲液
按上述(1)(2)所配制的溶液309/91的体积比混合即可配置0.2mol/LpH6.8的柠檬酸-磷酸缓冲液，此方法是从百度上查询的。配置柠檬酸-磷酸缓冲液的体积依据试验所需，切勿配置过多。试验前先放置在冰箱中冷藏。
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(4) 0.2%的邻苯二酚
精确称取0.1g邻苯二酚粉末加少量蒸馏水，用玻璃棒搅拌，直到完全溶解，再用蒸馏水定容到50mL。此溶液需要避光保存。 1.3 实验方法 1.3.1 材料处理
姬娜苹果、青蛇果、红蛇果、家优鲜红富士苹果、金帅五个品种苹果处理时在每个温度每个时间下设3次重复，将苹果用自来水清洗表面后去皮(去皮厚度大约为lmm)、纵切成4块后去除果心再横切一分为二(厚度为大约为20mm)，分别放置在0℃、4℃、8℃的冰箱内贮存和20℃、25℃的SHP-250生化培养箱内贮存。每隔12小时取样一次，并放于-20℃的冰箱内保存待测，贮存72小时后结束该实验。
1.3.2 多酚氧化酶(PPO)活性的测定
参照姜绍通[9] 和Halim[10] 等的方法, 并加以改进。
（1）酶液的提取:取预处理的样品5g,加入100mL柠檬酸-磷酸缓冲液, 用匀浆机打浆后,用离心机以8000r/min离心10min，上清液即为多酚氧化酶粗酶液。 （2）多酚氧化酶(PP0)活性的测定：取4支干净的试管，分别标号为1、2、3、4号。1号为对照组，2、3、4号分别为实验组。取2mL柠檬酸-磷酸缓冲液，分别加入到1、2、3、4号试管中，再分别加入2mL邻苯二酚溶液，最后1号试管加入2mL柠檬酸-磷酸缓冲液，2、3、4号试管加入2mL提取的粗酶液。用722G型可见分光光度计在415nm处测定吸光值，2min后再计吸光值。一个酶活力单位定义为：在测定条件下，每分钟引起光密度值改变0.001所需的酶量。每组重复3次，结果取平均值。切记先加缓冲溶液，后加邻苯二酚溶液。 1.4 数据处理
数据处理分析用Excel2007软件进行。
2 结果与讨论
2.1 鲜切苹果在不同贮藏温度下多酚氧化酶活性的变化 2.1.1 鲜切青蛇果在不同贮藏温度下多酚氧化酶活性的变化
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2001801601401201008060402000h12h24h36h48h60h72h0℃4℃8℃酶活性/U20℃25℃时间/h 图1 鲜切青蛇果多酚氧化酶活性的变化 从图1可以看出，温度对鲜切青蛇果多酚氧化酶活性的变化有很大的影响。青蛇果经过切割后，多酚氧化酶活性明显升高，尤其是20℃和25℃处理组。整体来看，多酚氧化酶（PPO）活性在0~24h内显著增大,贮存24h时PPO达到峰值，然后逐渐下降。在20℃和25℃条件下贮存的样品，其多酚氧化酶的活性明显高于在0℃、4℃和8℃条件下贮存的。高温条件下酶活性较高,低温条件可抑制多酚氧化酶活性, 从而控制鲜切苹果酶促褐变的发生。 2.1.2 鲜切姬娜苹果在不同贮藏温度下多酚氧化酶活性的变化 图2 鲜切姬娜苹果多酚氧化酶活性的变化 从图2可以看出，20℃和25℃条件下贮存的鲜切姬娜苹果的PPO活性在0~24h
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迅速升高,而在0℃、4℃和8℃三个温度处理的条件下的PPO的活性变化较慢，都在24h时多酚氧化酶的活性达到最大后迅速下降。贮藏后期PPO活性下降的原因可能是由于鲜切苹果的衰老导致其各种代谢的减缓,另外多酚氧化酶催化的褐变产物对PPO也有一定的抑制作用。
2.1.3 鲜切红蛇果在不同贮藏温度下多酚氧化酶活性的变化
2001801601401201008060402000h12h24h36h48h60h72h0℃4℃8℃20℃25℃酶活性/U时间/h
图3 鲜切红蛇果多酚氧化酶活性的变化
从图3可以看出，温度对鲜切红蛇果多酚氧化酶活性的变化有着很大的影响，一定的低温环境有利于抑制多酚氧化酶酶活性。25℃时其多酚氧化酶的活性最高，不利于鲜切红蛇果的贮藏。而低温条件下0℃和4℃其多酚氧化酶的活性较低，有利于鲜切红蛇果的贮存。随着贮藏期的延长，酚类物质的积累和PPO酶活性提高造成细胞组织结构和内膜系统的破坏，从而促使酶促氧化反应进行而导致组织褐变[11]。
2.1.4 鲜切家优鲜红富士苹果在不同贮藏温度下多酚氧化酶活性的变化
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