5、二氧化碳生成的检验
（1）观察三角瓶中的发酵液有无气泡溢出； （2）滴入10%氢氧化钠1ml于发酵液试管中，观察，如气体逐渐消失，则说明有二氧化碳的存在；
6、二氧化碳生产量的测定 （1）接种完，擦干瓶外壁，于天平上称量，记为W1; （2）实验结束，取出瓶轻轻摇动，使二氧化碳尽量溢出，在同一天平上称量，记为W2； （3）二氧化碳生成量= W1-W2 7、酒精生成的检验
（1）打开瓶塞，嗅闻有无酒精气味； （2）取发酵液5ml，加10%硫酸2ml；
（3）再加入1% K2Cr2O7溶液10-20滴，如颜色由黄色变为黄绿色说明有酒精产生。 K2Cr2O7+H2SO4+CH3CH2OH——CH3COOH+K2SO4+Cr2（SO4）3 实验器材及试剂：
菌种：活性干酵母 试剂：培养基各成分、大米粉、活性干酵母、淀粉酶、糖化酶、大可乐瓶 溶液：10% H2SO4、1%K2Cr2O7、10%NaOH
器材：试管、培养箱、灭菌锅、三角瓶、水浴锅、粉碎机、离心机 实验结果：
1、 详细记录实验过程中各参数及数据。
淀粉 100g 淀粉酶 10g 答:
1二氧化碳生成的检验培养约48h后，观察瓶中混合液，淀粉大部分沉降在瓶底，上清浓度较稀，靠瓶壁边缘有一连串微小气泡
2酒精生成的检验打开瓶塞，闻到有浓重酒精气味。取发酵液5ml, 加10%硫酸2ml,加1%K2Cr2O7溶液10-20滴，颜色由黄色变为黄绿色，稍加热后现象产生更快，更明显。
思考题：现有3株不同来源的酒精酵母，请设计与本实验操作不同的实验，判断哪株酵母发酵酒精能力最强？
答：按实验步骤配制等量的三组醪液，加入等量糖化酶进行糖化作用，将原料中的淀粉转化为可发酵性糖，向三组糖化后的淀粉上清中加入等量3株不同来源的酒精酵母种液，相同条件下培养一段时间，分别测定三组实验产生的CO2的质量，进行比较。产CO2越多表示发酵酒精能力越强。
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CaCl2 0.17g 糖化酶 2.5g 2.对实验结果的判断与分析。
实验四 黑曲霉固体发酵生产纤维素酶及酶解底物反应
（5学时）
实验目的：
1、了解黑曲霉固体发酵产酶情况 2、掌握微生物固体发酵操作技术
3、了解纤维素酶提取方法及酶活性定性测定方法
实验原理：纤维素酶是降解纤维素的一组酶的总称，是起协同作用的多组分酶系，属
于诱导酶，其产生需要纤维素类物质的诱导。实验中以米曲霉为发酵菌株，稻草作为产酶诱导物。
实验内容
1、黑曲霉菌种活化
（1）配制PDA培养基：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000ml煮沸半个小时，纱布过滤，再加20g葡萄糖和20g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
（2）在无菌超净台上接种保藏的黑曲霉于PDA斜面，28℃培养5-7天，斜面上长满孢子。
2、配制发酵培养基：15g麸皮+10g稻草粉，0.5%KH2PO4，0.5% (NH4)2SO4，加15ml水（加水量40%～60%），拌匀，装瓶；
3、灭菌：121℃ 灭菌30min，冷却至室温。 4、黑曲霉孢子悬浮液制备
已培养好的黑曲霉孢子斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下孢子，制成孢子悬液。 5、接种：用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于30度条件下培养96h，期间每隔12h摇动三角瓶一次。
6、提取粗酶液
向瓶中加入无菌水约50ml，浸泡固体曲30min-1h；过滤得粗酶液。 7、酶活性测定
（1）配制1%CMC底物平板：
配方：1g羧甲基纤维素钠，1.8g琼脂， 100ml，琼脂完全溶解后，加入0.03g曲利本蓝，倒平板，每皿约15ml。
（2）打孔：打孔器经酒精燃烧灭菌后，每平板打4孔，并在酒精灯火焰上稍稍加热打孔处，使孔周围的培养基微融，然后平放冷却。
（3）加样：往孔内加入粗酶液适量（约100ul），同时需设对照。
（4）培养（反应）：将加样后的平板小心平端放入30℃培养箱，放置20小时左右。 （5）观察结果：可直接观察透明圈有无、测定透明圈直径。
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实验器材及试剂：
菌种：黑曲霉
试剂：土豆、稻草、麸皮、硫酸铵、羧甲基纤维素钠（CMC） 器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶
实验结果：
1、 仔细观察固体培养基发酵前后的状态，并描述；
答：固体培养基发酵前：培养基颜色较浅，各成分（麸皮、稻草）新鲜，粘度大成团状
固体培养基发酵后：培养基中产生较多黑色孢子及菌体，培养基营养成分被利用，体积缩小
2、 仔细观察底物平板酶解前后的现象，并测量水解圈大小。
现象：纸片周围出现浅浅的水解圈，打孔培养基未出现水解圈，纸片直径2.5cm，水解圈3cm，直径比5:6
思考题：纤维素是自然界最丰富的资源，从理论角度分析如何最大限度地通过酶法利用该资源？而现实存在什么问题？目前对纤维素降解有哪些研究进展？
答：要想最大限度的利用纤维素，可从两个方面入手。一是通过生产高性能纤维素酶的方法，二是找到蕴含能量较高的纤维素。而现实中存在的问题是高性能纤维素酶的获取，
而可以通过诱变和筛选获得可产生纤维素酶的新菌株。目前在纤维素的降解方面，微生物的研究较多，降解纤维素的真菌有很多，如木霉属、青霉属、曲霉属、根霉属、漆斑霉属、枝顶孢霉属、毛壳霉属和脉孢霉属等。其中，很多纤维素降解真菌在生长过程中能产生菌丝， 菌丝具有很强的穿透能力，能穿透植物角质层的阻碍，紧紧依附和穿插在纤维物质上， 增大降解酶与纤维物质的接触面积，从而加快降解速率。如木霉属、青霉属、漆斑霉属、毛壳霉属和脉抱霉属为丝状真菌。目前，木霉属是迄今所知纤维素酶系最全面和研究较多的一个属。
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实验五 甘露聚糖酶液体发酵及酶解反应（6 学时）
实验目的：
1. 2.
了解并掌握液体发酵产酶操作及酶反应条件的控制 与固体发酵产酶进行比较分析
甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，其主链是由吡喃甘露糖残基以1,4-β-D糖苷键连接而成。当主链的某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过1,6-α-糖苷键与甘露糖残基相连形成分枝，则称之为异甘露聚糖，主要有半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖和半乳葡萄甘露聚糖。甘露聚糖是半纤维素的第二大组分，在自然界中分布广泛，且多以异甘露聚糖的形式存在，同型甘露聚糖十分少见。β-甘露聚糖酶以内切方式降解甘露聚糖主链产生不同聚合度的甘露寡糖和少量甘露糖，是甘露聚糖降解酶中最关键的酶。
甘露聚糖酶可广泛应用于食品、造纸、纺织印染等行业。利用β-甘露聚糖酶可以制取有特殊保健作用的甘露寡糖。在纸浆制造业，可用于代替碱法进行脱色、漂白。在纺织印染方面，利用β-甘露聚糖酶与其它酶联合作用，能有效去除产品上粘附的多余染料，降低能耗和对环境的污染等。甘露聚糖酶的工业化生产将在许多行业产生很大的经济和社会效益。因此，近年来甘露聚糖酶逐渐成为国内外关注和研究的热点之一。甘露聚糖酶是一种半纤维素酶，其产生需要一定的诱导物存在。本实验以枯草芽孢杆菌为菌株，以魔芋粉为诱导物。
实验原理
实验内容
1. 菌种活化
（1）配制LB固体培养基：蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂 20g/L，待琼脂充分溶解后趁热纱布过滤，分装试管，每试管约5-10ml（视试管大小而定），15磅蒸气（121℃）灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面，冷却后贮存备用。
（2）在无菌超净台上接种保藏的枯草芽孢杆菌于LB斜面，28℃培养2天。 2. 配制产酶培养基：蛋白胨10g/L， 酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，魔芋粉 30g/L，
3. 以10%的体积量分装于三角瓶中（25ml液体培养基/250ml三角瓶），121℃灭菌20分钟； 4. 菌悬液的制备
已培养好的枯草杆菌斜面一支，加入约10ml无菌水，洗下菌体，制成菌悬液。 5. 接种
用移液管在无菌条件下吸取一定量的悬液，移入灭菌好的固体培养基中，于37度200rpm条件下培养72h。
6. 粗酶液提取：3000rpm离心收集得到粗酶液
7. 酶解底物分析：准备两三角瓶，分别加入50ml自来水，46度水浴保温
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8. 往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，然后其中一个加入粗酶液1ml，另一个加入1ml蒸馏水（做空白对照）。以后每隔5-10min往两三角瓶中各加入1g魔芋粉，前后共加5g
9. 酶解反应30-60min，期间观察反应现象。 实验器材及试剂：
菌种：枯草芽孢杆菌 试剂：蛋白胨、酵母粉、氯化钠、魔芋粉 器材：培养箱、灭菌锅、三角瓶、摇床、离心机、天平、三角瓶
实验结果：
1、 仔细观察液体培养基发酵前后的状态，并描述；
答：
①发酵之前的液体培养基的状态：在配制产酶培养基时，魔芋粉难溶解，依
旧是固体颗粒。等完全灭完菌后，放正在实验台上，等冷却后，状态比较像固体培养基，但魔芋粉依旧不溶解，其颗粒均匀地分布于培养基中。
②经过三天的培养之后，产酶培养基被液化，得到的是含有粗酶液的液体培养基，完全呈黄褐色的液体状 2、 仔细观察底物水解前后的现象。
答：对照组：魔芋粉结成团，透明，具有弹性，黏度很大，无法搅拌，实验难以继续。 实验组：魔芋粉已被完全酶解，三角瓶中完全是液体状的酶解产物，溶液呈透明状。
思考题：
以本人液体发酵产酶为例，请详细介绍甘露聚糖酶定量测定的原理与方法。 答：原理：样品中的甘露聚糖酶对底物－半乳甘露聚糖进行水解，用DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸）分光光度法测定水解所产生的还原糖量。
方法：别向2支试管中加入1.8mL底物溶液，置50℃水浴中保温5min。在其中一支试管中加入200μL稀释酶样，磁力旋转搅拌均匀，置于50℃水浴中准确保温5 min。加入3.0 mL DNS试剂至两支试管中，搅拌均匀。在另一支试管（空白管）中加入200μL稀释酶样，同时将两支试管放入沸水浴中准确保温5min，取出置入冷水中冷却至室温。于540 nm处测量酶样对空白的吸光度，在酶活标准曲线上读取酶活，再乘以酶样稀释倍数。
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