【正文】 结核分枝杆菌（TB）核酸扩增（PCR）荧光检测试剂
盒说明书 Operation Introduction for Mycobacterium tuberculosis(TB) PCR Fluorescence Diagnostic Kit 前言
本试剂盒采用一对PCR引物和一个荧光双标记的探针，该探针能与引物扩增区域中间的一段DNA模板发生特异性结合，从而将PCR技术和荧光检测技术结合起来，实现了对TB核酸的自动化检测。检测灵敏度为10个TB菌/毫升。试剂盒在PCR循环结束后无需开盖。试剂盒中采用了dUTP-UNG酶防污染系统。本品可用于可疑结核病患者经处理的痰液标本结核分枝杆菌核酸的定性检测，可用于结核病的辅助诊断。试剂盒组成
※ 贮存条件及有效期本试剂盒贮存于-20℃的条件下有效期为一年（请于有效期内使用）。
自备试剂 4％ NaOH、灭菌生理盐水样本采集、存放及运输
1．采集：以清晨第一口痰为宜。先用清水漱口，嘱患者用力咳出深部的痰于无菌样本保存管，密封，即可送检。
2．存放：待测样本在2-8℃保存不应超过24小时；
-20℃保存不超过三个月；-70℃以下长期保存。应避免反复冻融。
3．运输：采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。适用仪器 1．BIO-RAD iCycler荧光PCR检测仪、PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪 2．Roche LightCycler荧光PCR检测仪 3．其它荧光PCR检测仪，如PE-5700、PE-7000、基因公司Rotor-Gene、MJ公司Opticon Monitor、大和Line-Gene荧光定量PCR检测仪等使用方法
1．样本处理（样本处理区）
1.1. 首先对痰液样本进行目测，若样本中唾液占绝大部分，则需重新采集样本。
1.2. 目测合格后，在样本中加入2～3倍体积4%的NaOH溶液，置于摇床上，在150rpm、37℃条件下处理30min或常温下1Hr，使其充分液化（无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4%的NaOH溶液直至液化完全）。
1.3. 取液化后的样本900ul以及试剂盒中的阴性对照、强阳性对照和临阳性对照各500ul于1.5ml无菌离心管中，13,000rpm离心10min。
1.4. 弃上清（先倒出大部分液体，再用移液器尽量吸
干至无明显液滴为止），沉淀中加入1ml灭菌生理盐水，振荡悬浮（注意：按紧离心管盖后，横向按在旋涡振荡器上将沉淀振起），13,000rpm离心10min。 1.5. 弃上清，用1ml灭菌生理盐水洗涤沉淀，13,000rpm离心10min。
1.6. 弃上清，向沉淀中加入DNA提取液30ul，振荡混匀，2,000rpm离心5sec，放37℃温浴30min，再放入100℃水浴/干浴10min，13,000rpm离心10min，保留上清备用。（如果样本裂解产物当天不使用，请于-20℃保存。）
2．扩增试剂准备（PCR前准备区）从试剂盒中取出TB PCR反应液、Taq酶及UNG，室温融化并振荡混匀后，2,000rpm离心10sec。设所需要的PCR反应管管数为n（n=样本数+1管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照），每个测试反应体系配制如下表： ※ ※ 计算好各试剂的使用量，加入一适当体积离心管
中，充分混合均匀，2,000rpm离心10sec，向设定的n个PCR反应管中分别加入相应体积的反应液（40ul体系加入38ul，20ul体系加入18ul），转移至样本处理区。
3．加样（样本处理区）若样本裂解产物保存在-20℃,
置室温解冻后13000rpm离心5min。向所设定的n个反应管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和临界阳性对照上清液各2ul，盖紧PCR反应管管盖
【使用Roche毛，转移至检测区。将反应管排好置于荧光PCR检测仪细管时，将毛细上，记录样本摆放顺序。 管连同Roche专 4．PCR扩增（检测区）
用金属反应管套 4.1. 循环条件设置使用PE Gene Amp
放在离心机中，7700/5700/7000荧光PCR检测仪时循环程序设置如于2000rpm离心下： 37℃：5min；94℃：1min； 95℃：5sec，60℃：
10sec】 30sec，40个循环。反应体系为40ul。使用Bio-Rad
iCycler荧光PCR检测仪时循环程序设置如下： 37℃：5min；94℃：1min； 95℃：5sec，60℃：30sec，42个循环。反应体系为40ul。使用Roche LightCycler荧光PCR检测仪时循环程序设置如下: 37℃：3min；93℃：1min； 93℃：5sec，60℃：40sec，40个循环。反应体系为20ul。循环程序设置均应在扩增开始前样本设定时，将待检样本和对照品设定为“UNKN”。 4.2. 仪器检测通道选择 PE7700和iCycler属多荧光检测仪，荧光信号收集时设定为Fam荧光素。荧光信号收集设在60℃。 Roche LightCycler荧光PCR检测
仪，仪器通道选择F1通道。荧光信号收集设在60℃，收集方式设为SINGLE。其它类荧光PCR检测仪的具体循环程序设置方法请参照以上设置方法以及各类仪器使用说明书和实际情况而适当调整。 结果分析条件设定
1．使用PE Gene Amp 5700/7000荧光PCR检测仪进行结果分析时基线（baseline）的确定：取6—10或6—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。
2．使用PE Gene Amp 7700荧光PCR检测仪进行结果分析时基线（baseline）的确定：取3—10或3—15个循环的荧光信号。阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=40.0为准。
3．使用BIO-RAD iCycler进行结果分析时，基线（baseline）取为2—10或2—15个循环的荧光信号，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值=0.0为准。也可根据仪器噪音情况在15.0—40.0之间调整。（在使用以上荧光检测仪进行分析的过程中，为避免漏检强阳性样本，应首先将基线定为