总体上，它包括以下步骤：1)采用不同分离机制的色谱分离方法检测有关物质，结合合成、制备路线与MS的检测推测有关物质的可能结构，然后取可能存在的杂质(如合成过程中的原料、中间体等)与含杂质的药物进样，在相同的色谱条件下考查已知化合物与该杂质的保留时间是否一致；也可将已知化合物加入含杂质的药物中，考查拟确定的杂质峰面积是否有变化。2)利用光电二极管阵列检测器(DAD)，观察拟定性的有关物质的紫外吸收，或与已知化合物的紫外吸收光谱进行对比，分析该杂质结构中可能存在的官能团。3)采用GC-MS或LC-MS-MS联用技术，为有关物质的结构确定提供相关信息；或利用LC-IR和LC-NMR等联用技术，在不分离杂质的情况下在线获得杂质的IR和NMR图谱；或利用制备型色谱获得有关物质的样品，然后通过IR、MS、NMR的检测，确定有关物质的结构。4)合成已知结构的有关物质，并与药物杂质的色谱数据和光谱信息进行对照，以确定有关物质，并建立其定量测定方法。
1.5 国内外对原料药中杂质谱的分析方法及最新进展
有关物质的种类与药物的合成路线和制剂工艺密切相关，药物在合成和制剂工艺过程中的任何一个因素的改变都可能导致其有关物质的种类不同，因而有关物质的检测和控制过程相对复杂。药物中的有关物质大多具有潜在的生物活性，有的甚至会与药物发生相互作用从而影响药物的安全性和有效性，严重时甚至会产生毒性作用[12]，因此有关物质研究是药物质量研究中最重要的一个方面，同时也是药品开发过程中的一个重要内容。根据人用药品注册技术规范国际协调会(简称ICH)准则的要求，药物中杂质的限度仅为0.10%(毒性药物限度则更低)，高于此水平的所有未知杂质均应被鉴别且定量，此外，还应对这些杂质进行毒性研究[6]。因此，有关物质的测定对于确保药物质量和用药安全、有效是非常必要的。因有关物质多为微量，必须选择专属性强、灵敏度高、重复性好的检测方法，目前首选的是色谱法，可根据新药的具体品种及其有关物质的性质选用高效液相色谱法(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、气相色谱法(GC)等或波谱分析技术，包括HPLC-MS或GC-MS等联用技术。有关物质的常用测定方法主要包括如下几种。
1.5.1 薄层色谱法
TLC法的特点是简便，易于操作，可同时分离多个样品，分析成本低，对样品预处理要求低，且可同时检测极性大和极性小的杂质[13]，故在药物杂质检查中应用十分广泛，在各国药典中都有多种药物采用此方法检查有关物质。而且，也有人尝试将TLC法用于药典中未采用此法测定其有关物质的药品，如罗功才
[14]
采用硅胶G板，以甲苯-甲醇(8：2)为展开剂，1%二苯胺硫酸溶液为显色剂，
对硝酸异山梨酯的有关物质进行了检查。结果显示：该法简便易行，重复性好，杂质的最低检出量为90ng。但在有关物质的测定中TLC法只能达到定性或半定量的目的，且由于灵敏度受操作条件影响较大，因此难以满足快速定量分析的需要。
1.5.2 高效液相色谱法
HPLC法具有分离效能高、分析速度快和检测灵敏度高等特点，已被广泛应用于药物中有关物质的测定。目前，HPLC测定有关物质的定量方法主要有杂质对照品法(外标法)、主成分自身对照法和峰面积归一化法。 1.5.2.1 杂质对照品法
当药物中有关物质已知并可获得其对照品时，可采用杂质对照品法测定单个杂质的含量。该法专属性强，灵敏度与准确度均较高，但由于通常较难获得杂质对照品，不能广泛使用。Chandorkar等[15]采用该法对盐酸坦索罗辛中已知杂质[5-(2-氨基丙基)-2-甲氧基苯磺酰胺]进行了测定，色谱条件为：色谱柱为Lichrosphere C8柱；流动相为乙腈-磷酸二氢钾缓冲液(50：50，用磷酸调节pH至5.0)；检测波长为275nm。结果，该方法回收率达99%，重复性和回收率的RSD均小于1%，检测限为6ng。 1.5.2.2 主成分自身对照法
主成分自身对照法又可分为加校正因子和不加校正因子两种。
(1)若杂质已知但无对照品，可采用加校正因子的主成分自身对照法对杂质进行定量检测。例如，刘文华等[16]以Alltech C18柱为色谱柱，乙腈-磷酸二氢铵缓冲液(10：90)为流动相，在280nm检测波长下测定头孢丙烯合成起始原料和中间体以及头孢丙烯的色谱峰面积，计算各校正因子，采用该法对头孢丙烯原料药等有关物质进行了测定，结果各有关物质均达到了较好的分离。该法的优点是可减小杂质与主成分的响应因子可能不同所引起的测定误差，故准确度较高；缺点是在检验时没有杂质对照品，必须根据相对保留时间确定杂质峰在图谱中的位置，而相对保留时间在不同实验条件下可能有所波动，特别是当供试品中存在多个杂质且分离效果不佳时，更难确定色谱图中的杂质峰。
(2)若杂质未知或无法获得杂质对照品，可采用不加校正因子的主成分自身对照法对杂质进行检测。该法不但操作简便，且无需对照品，但由于忽略了各杂质与主成分的响应因子有可能不同，从而使实验测得的杂质含量可能存在误差，其测定误差要比加校正因子的主成分自身对照法更大。当杂质对主成分的校正因
子超出0.9~1.1范围时，应采用加校正因子的主成分自身对照法测定。当采用主成分自身对照法时，检测波长的选择是否合理直接影响到有关物质的检测结果。若将主成分的最大吸收波长确定为有关物质检测的波长，而杂质在此波长下的吸收与主成分差异较大，则所测结果不能真实地反映药品中杂质含量。因此在选择检测波长时应综合考察主成分和杂质的紫外吸收特性，既要保证有关物质在该波长下有较高的灵敏度，又要尽量减小有关物质与主成分之间的响应差异。可通过二极管阵列检测器(DAD)来考察主成分和各个杂质的紫外吸收特性，选取响应基本一致的波长作为有关物质的检测波长。如王桂云等[17]在奥美沙坦酯的有关物质检查中，采用DAD对奥美沙坦酯和5个中间体的紫外吸收特性进行了考察，发现奥美沙坦酯和5个中间体的紫外最大吸收波长分别为254、258、261、264、256和252nm，且吸收强度也相似，故最后选定接近主峰且近似于平均值的波长(256 nm)作为有关物质的检测波长。 1.5.2.3 峰面积归一化法
若只需粗略考察杂质的含量，可采用峰面积归一化法。杨倩等[18]采用该法对盐酸平阳霉素及注射用盐酸平阳霉素中有关物质进行了测定，色谱条件为：C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)；以己烷磺酸钠溶液(pH4.2)为流动相A、甲醇-乙腈(70：30)为流动相B，进行梯度洗脱；检测波长为254nm。结果，主峰与杂质能较好分离，最低检测质量浓度达1mg/L。峰面积归一化法的特点是其测定值基本不受称样量及进样量的影响，故重复性良好。但需指出的是，只有在所有成分均出峰、所有杂质均与主成分分离且响应因子相同时，该法的结果方可真实准确。此外，当所含杂质为微量时，需通过增加进样量来确保检测灵敏度，此时主成分响应值可能超出仪器检测范围。
1.5.3 气相色谱法
GC法具有选择性好、灵敏度高、进样量小、分析速度快等特点。李丹等[19]采用毛细管GC法对β-石竹烯醇的有关物质进行了测定，考察了不同色谱柱和柱温程序升温对分离效果的影响，并用气相色谱-质谱(GC-MS)确定了有关物质主要为β-石竹烯醇共存物—α-榄香醇、长叶烯醇和丁子香烯醇。与TLC法和HPLC法相比，GC法要求样品能够气化且具有热稳定性，故较少用于有关物质检查。2005年版中国药典[3]中只有林旦等少数几个化学药品采用GC法进行有关物质的检查。
1.5.4 毛细管电泳法
毛细管电泳法(CE)近年来发展迅速，与HPLC法相比，具有快速、高效、进样量小、分离模式多等优点。尽管目前受自身灵敏度和重复性的限制，CE法在药物的杂质研究中的应用还不普遍，但当HPLC法不能获得很好的分离效果时，CE法可能是一个不错的选择。Jouyban等[20]对近年来CE法在药物杂质研究中的应用做了总结，指出：目前毛细管区带电泳法(CZE)在各种分离模式中应用的最多，主要用于离子型和可电离药物的分析；胶束毛细管电色谱(MEKC)和微乳液毛细管电动色谱(MEEKC)则比较适合疏水性药物的分离；等速电泳(ITP)等其它分离模式应用的较少。有一个例子是Jankovics等[21]采用CE法检查不同厂家的苯磺酸氨氯地平中有关物质，电泳条件为：缓冲液为25mmol/L柠檬酸缓冲液(pH7.0)-甲醇(80：20)；分离电压为30kV；检测波长为223nm；内标为盐酸普鲁卡因。其检测结果与采用欧洲药典规定的HPLC法的结果基本一致。
1.5.5 毛细管电色谱法
毛细管电色谱法(CEC)是20世纪90年代初兴起的一种新型分离分析技术，它综合了HPLC法和CE法的优点，具有高柱效、多选择性、流动相体系相对简单、峰容量大、易于联用等特点。Orlandini等[22]采用CEC法对酮咯酸及其有关物质进行了分离，并通过对缓冲液的pH、乙腈的浓度、有机改性剂的种类和电压强度等因素的优化考察，确定了最佳分离条件：流动相为50mmol/L甲酸铵缓冲液(pH3.5)-水-乙腈(10：20：70)；检测波长为323nm；电压为30V；温度为20℃；内标为氟灭酸。结果，9分钟内主药和3种有关物质达到基线分离。但目前CEC技术还处于研究阶段，在日常分析中使用较少，其检测结果的重复性差等问题还有待进一步解决。
1.5.6 超临界流体色谱法
超临界流体色谱法(SFC)是20世纪80年代初发展并得以广泛应用的色谱分离技术。该技术以超临界流体为流动相，以固定吸附剂或键合到载体上的高聚物为固定相，必要时加入甲醇等极性物质为改性剂来改善分离性能。SFC法具有分析速度快、选择性好、分离效率高和样品处理简单等优点，适用于热稳定性差、极性大和挥发性小的药物。Toribio L等[23]采用手性填充柱SFC法对4种抗真菌药进行了手性拆分，并考察了不同改性剂对保留时间和分离度的影响，发现在使用甲醇为改性剂的条件下，咪康唑、益康唑、硫康唑与其各自的对映异构体在10分钟内均能达到很好的分离效果；而伊曲康唑需使用异丙醇-乙醇(85：15)为
改性剂时才能与其3个异构体达到基线分离。由于SFC技术检测结果的重复性差，目前在有关物质测定中并不常用。
1.5.7 联用技术
色谱-质谱联用技术是目前发展最为成熟的联用技术，其中液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术在有关物质的结构确定和降解产物的产生机制研究中有着广泛的应用。Ermer等[24]介绍了LC-MS技术在有关物质研究中的应用情况，一方面，可利用LC-MS法对色谱峰进行峰纯度检查，以验证分析方法的可靠性；另一方面，可通过高分辨质谱提供的元素组成信息和LC-MS-MS法提供的碎片离子信息来推断杂质的结构。
除色谱-质谱联用外，液相色谱-核磁共振波谱联用(LC-NMR)是人们关注的另一个焦点。LC-NMR技术在药物分析中主要用于药物中杂质、药物代谢的产物以及手性药物的分析等。Vasu Dev等[25]在对雷贝拉唑钠片进行稳定性试验研究的过程中，发现经6个月加速试验的样品产生了3个新的降解产物，采用停留模式LC-NMR和高分辨LC-MS技术得到了降解产物的NMR和MS信息，并将这些信息与雷贝拉唑的结构信息进行比较，确定了3个杂质的结构，并推断降解产物可能源自碳硫键氧化断裂和雷贝拉唑自身结构的重排。
目前，对有关物质进行结构鉴定已成为有关物质研究技术要求的重要组成部分。应用色谱-质谱联用技术对有关物质进行结构鉴定屡见报道。例如，在对洛匹那韦原料药中有关物质进行研究时，Chitturi等[26]首先采用HPLC法对洛匹那韦粗品进行初步检测，发现共有10个有关物质(RS1~RS10)，将起始原料、中间体等可能的有关物质与样品中杂质的保留时间进行比较后发现，RS1为合成的中间体，RS2为起始原料，RS3为洛匹那韦的水解产物；然后应用LC-MS和LC-MS-MS技术分析样品，分别得到RS3~RS10的分子质量和碎片离子的信息，进一步结合洛匹那韦的结构及合成过程，推测出这几个未知杂质的可能结构；最后，将通过制备型色谱得到的几个未知杂质的纯品进行NMR和IR分析，以验证先前的推测，从而确定了有关物质的结构。
1.6 结语
药物中有关物质的研究是药物研发和质量控制的一个重要方面，贯穿于药品研究、生产、储存的全过程。药品中的有关物质是否能得到合理、有效的控制，直接关系到药品质量的可控性和安全性。目前含量在0.1%左右的有关物质是人们研究的热点，综合利用各种分析手段建立准确、快速、灵敏度高的检测分析方