微生物细胞(4)

2019-06-11 10:46

核骨架:核纤层+核基质,细胞松弛素特异性保护微丝的组装。 细胞膜骨架

细胞膜下由纤维蛋白组成的网架结构。膜骨架一方面直接与膜蛋白结合,另一方面又能与细胞质骨架相连,主要参与维持细胞质膜的形态,并协助细胞膜完成某些生理功能。

细胞冻存、复苏(原则:慢冻快融)

当细胞冷到零度以下,可以产生以下变化:细胞器脱水,细胞中可溶性物质浓度升高,并在细胞内形成冰晶。

如果缓慢冷冻,可使细胞逐步脱水,细胞内不致产生大的冰晶;相反.结晶就大,大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重结晶。 细胞冻存方法

1.预先配制冻存液,避免因临时配制产热而伤害细胞: 含20%血清培养基,10% DMSO

2. 取对数生长期细胞,经胰酶消化后,加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液(1×106 ~ 5 ×106细胞/ml)

3 .加入1ml细胞于冻存管中,密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期,放入液氮冻存。4年后,存活率可达80%-100%。 细胞复苏方法

(l)从液氮中取出冷冻管,迅速投入37~38 ℃水浴中,使其融化(1分钟左右)。 (2)5分钟内用培养液稀释至原体积的10倍以上。 (3)低速离心10分钟。

(4)去上清,加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。

细胞凋亡检测(形态学检测(荧光染色法)、生化(DNA ladder)):

1 吖啶橙(AO)能透过胞膜完整的细胞,嵌入细胞核DNA,使之发出明亮的绿色荧光。正常细胞——细胞被均匀染成黄绿色荧光;凋亡细胞——染色质浓缩,细胞核碎裂成点状,被染成大小不一、致密浓染的绿色颗粒。但对早期凋亡细胞核活细胞很难区别

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2 溴乙锭(EB):仅能透过胞膜受损的细胞,嵌入核DNA,发橘红色荧光。 3 双染:FITC-AnnexinV :AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,与磷脂酰丝氨酸(PS)有高度亲和力,故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinV进行绿色荧光素FITC标记,以标记了的AnnexinV作为荧光探针,利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 4 DNAladder:细胞凋亡时DNA在核小体间断裂 (DNA fragmentation ) 形成一些DNA片断,经过提取和纯化后在凝胶电泳上产生n条带,由于这些DNA条带经染色并成像之后的整体类似于梯子上的一个个踩踏板, 故称之为DNA Ladder 细胞活力测定(MTT法)

台盼蓝法:活细胞不被染色,死细胞染成蓝色,用活细胞占细胞中的百分比表示细胞活力 (已淘汰)

四唑盐(MTT)(噻唑蓝)比色法:四吐盐比色法的原理:活细胞中脱氢酶能将四唑盐还原成不溶于水的蓝紫色产物(formazan),并沉淀在细胞中,而死细胞没有这种功能。二甲亚砜(DMSO)能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物,溶液颜色深浅与所含的formazan量成正比。再用酶标仪测定OD值。

被动运输:(简单扩散、促进扩散(离子通道扩散、易化(帮助)扩散))小分子

简单扩散:①沿浓度梯度(或电化学梯度)扩散;②不需要提供能量;③没有膜蛋白的协助。脂溶性物质(非极性物质): 苯.乙醇.氧.氮;不带电荷小分子物质: 水.尿素.CO2

促进扩散:是指非脂溶性物质或亲水性物质, 如氨基酸、糖和金属离子等借助细胞膜上的膜蛋白的帮助顺浓度梯度或顺电化学浓度梯度,不消耗ATP进入膜内的一种运输方式。

主动运输(离子泵、协同运输(共同运输、反向运输))小分子:借助于镶嵌在细胞膜上专一性很强的载体蛋白,通过消耗代谢能量,将物质从低浓度处向高浓度处的运输方式。

离子泵( Na+-K+泵):泵为Na+-K+ATP 酶具有载体和酶的双重作用

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Na+-K+ATP酶通过磷酸化和去磷酸化过程发生构象的变化,导致与Na+、K+的亲和力发生变化。在膜内侧Na+与酶结合,激活ATP酶活性,使ATP分解,酶被磷酸化,构象发生变化,于是与Na+结合的部位转向膜外侧;这种磷酸化的酶对Na+的亲和力低,对K+的亲和力高,因而在膜外侧释放Na+、而与K+结合。K+与磷酸化酶结合后促使酶去磷酸化,酶的构象恢复原状,于是与K+结合的部位转向膜内侧,K+与酶的亲和力降低,使K+在膜内被释放,而又与Na+结合。其总的结果是每一循环消耗一个ATP;转运出三个Na+,转进两个K+。 质子泵: 质子泵有三类:P-type、V-type、F-type。

1、P-type:载体蛋白利用ATP使自身磷酸化(phosphorylation),发生构象的改变来转移质子或其它离子,如植物细胞膜上的H+泵、动物细胞的Na+-K+泵、Ca2+离子泵,H+-K+ATP酶(位于胃表皮细胞,分泌胃酸)。

2、V-type:位于小泡(vacuole)的膜上,由许多亚基构成,水解ATP产生能量,但不发生自磷酸化,位于溶酶体膜、动物细胞的内吞体、高尔基体的囊泡膜、植物液泡膜上。

3、F-type:是由许多亚基构成的管状结构,H+沿浓度梯度运动,所释放的能量与ATP合成耦联起来,所以也叫ATP合酶(ATP synthase),F是氧化磷酸化或光合磷酸化偶联因子(factor)的缩写。F型质子泵位于细菌质膜,线粒体内膜和叶绿体的类囊体膜上。F型质子泵不仅可以利用质子动力势将ADP转化成ATP,也可以利用水解ATP释放的能量转移质子。

协同运输;载体蛋白介导的物质运输中,许多主动运输不是直接由ATP提供能量,而是由储存在膜上离子梯度中的能量来驱动,这一能量来源与进行耦联运转的蛋白质相联系来完成物质跨膜运输,即一种物质的运输依赖于第二种物质的同时运输

共运输:Na+顺浓度梯度运转的同时伴有葡萄糖或氨基酸的逆浓度梯度运转。 对向运输:Na+-Ca+ 和Na+-H+交换载体Na+顺浓度梯度进入细胞时供给能量使Ca +逆浓度梯度排出细胞外,这是细胞向外环境驱钙的一种重要机制

膜泡(大分子:胞吞、胞吐):大分子及颗粒物质并不直接穿过细胞膜,而是通过一系列膜囊泡形成和融合来完成的转运过程,属于主动运输。 胞吞(胞饮作用、吞噬作用、受体介导的胞吞作用 )

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受体介导的胞吞作用:特异性受体与大分子物资结合后,通过膜囊泡系统完成转运

如LDL颗粒的运转

细胞内膜系统(细胞内膜系统是指细胞内在结构、功能及发生上相关 的由膜包绕形成的细胞器或细胞结构)

内质网:粗面内质网:蛋白质的合成与转运。滑面内质网:小分子物质的合成与代谢以及细胞的解毒作用(脂类的合成)

高尔基复合体:参与蛋白质的分类与包装、运输;多数糖基修饰;糖脂的形成;与高尔基体有关的多糖的合成

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