第五章 色谱原理
5.1
色谱的原理和分类
5.1.1色谱色基本原理
色谱技术是一种重要的分离和分析技术，其用于物质的分离始于二十世纪初。1903年，俄国植物学家Tswett向填充碳酸钙的柱中注 入植物色素的石油醚冲洗，发现柱中出现数条相互分离的色带，色谱法的命名就是由此发现开始的。随后色谱技术得到不断发展。Martin于1952年因创立气－液色谱分离方法而荣获诺贝尔奖。气相色谱的出现极大地鼓舞了世界各地的科学工作者，激发了人们对分析色谱技术进行放大，使之用于制备目的和工业生产的研究兴趣。资料表明，在50和60年代，分析和生产规模的气相色谱分离技术的研究十分活跃。到了70年代，尤其是在美国制糖工业采用酶法转化技术生产高果葡糖浆以后，液相色谱技术就变成了一个热门的研究领域。色谱在英文中只有一个名词Chromatography），但在中文中却有色谱和层析的名称。 色谱的主要装置如图所示;
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图 色谱的主要装置图
色谱实际是 色谱分离精度高，设备简单，操作方便，根据各种原理进
行分离的色谱法不仅普遍应用于物质成分的定量分析与检测，而且应用于生物物质的制备分离和纯化，成为生物下游加工过程最重要的纯化技术之一。 5.1．2色谱的分类 1) 流动相与固定相
色谱法根据流动相的相状态分气相色谱法、液相色谱法和超临界流体色谱
法，而固定相有固体、液体和以固体为载体的液体薄层。 2) 固定相的形状
根据固定相或色谱装置形状的不同，液相色谱法又分为纸色谱法（Paper chromatography）、薄层色谱法（Thin－layer chromatography）和柱色谱法（Column chromatography）。纸色谱法和薄层色谱法多用于分析目的，而柱色谱易于放大，适用于分离大量制备分离，是主要的色谱分离手段。 3) 分离操作方式
色谱法根据分离操作方式的不同可分为间隙色谱和连续色谱两大类。间隙色谱技术通过合理选择固定相介质和冲洗剂可以得到广泛应用。但是，在工业应用中更希望采用连续分离操作，尤其是分离过程必须与其他连续单元操作（如连续生化反应器）同时进行时更是如此。 5.1.3色谱的主要检测器
色谱峰的确定完全考检测器,所以检测器的好坏对色谱技术是十分重要的。气相色谱的检测器主要有以下几种：
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（1） 氢火焰检测器 （2） 热导检测器 （3） 离子检测器
这些检测器的主要功能如表所示 表 气相色谱检测器 检测器种类 优点 缺点 应用对象 灵敏度较低 氢焰离子化检测（1） 成本低廉 器（FID） （2） 通用性广 （3） 热导检测器（1）成本低廉 （TCD） 电子捕获检测器灵敏度高 （ECD） 设备昂贵 火焰热离子检测（1）对氮、磷化 器（FTD） 合物有高的选择性合灵敏度 火焰广度检测器 适合于农药、药物残留分析 液相色谱的主要检测器有紫外检测器、视差折光检测器、蒸发散射光检测器、等
其主要功能如表所示。
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表 液相色谱检测器的主要功能 检测器种类 紫外检测器 优点 （4） 成本低廉 （5） 通用性广 （6） 示差折光检测器 （1） (1) 不容易做梯度 (2) 灵敏度低 化学发光检测器 缺点 干扰大 应用对象 对有紫外吸收的有机物合蛋白质、核酸等适用 对糖类检测 蒸发散射光检测 器 荧光检测器 电化学检测器
5.1．4 生物分离制备液相色谱的类型和特点
气相色谱主要用于挥发性成分的分析。在生物产品的分离纯化中主要采用的液相色谱。液相色谱中有些主要是用于分析如反相色谱。液相色谱方法的主要特点是：分离效率高，选择性好，适用于各种多元组分复杂混合物的分离；应用范围从无机物到有机物，从天然物质到合成产物，从小分子到大分子，从一般化合物到生物活性物质等，可以说几乎包括了所有类型物质。
表1 适用于大规模生物分子分离纯化的主要色谱方法 分离分离原特点 理 应用 4
使用率/% 方法 离子交换 疏水色谱 亲和色谱 凝胶过滤 吸附色谱 共价色谱
其实上表只是给出了目前常用的生物产品用液相色谱。还有许多新的液相色谱。如分子印迹层析技术，。 5.1．5 液相色谱介质和操作形式
液相色谱介质主要是颗粒状、膜状和一体柱形式。颗粒状介质，包括球星颗粒、无定型颗粒等。膜状介质是将膜用作介质，一体柱介质又称为连续床或
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（1） 通常分辨率高。 （2） （2）选用介质得当时流速快，容量最适用于大量样品处理的前电荷 75 很高，样品体积不阶段。 受限制。 （3） 成本较低 适用于分离的任何阶段，尤（1）分辨率好。（2）流其是当样品的离子强度高疏水性 速快。（3）容量高，样〉33 时，即在盐析、离子交换和品体积不受限制。 亲和层析后使用。 （1）分辨率非常高。（2）适用于分离纯化的任何阶亲和性 流速高，样品体积不受段，尤其是样品体积大、浓60 限制。 度很高而杂质含量很高时。 （1）在分级方法中分辨率中等，但对脱盐效果适用于大规模纯化的最后步优良。（2）流速较低，分子大骤，在纯化过程的任何阶段对分级每周期约〉8小50 小 均可进行脱盐处理，尤其适时，对脱盐仅30分钟。用于两种缓冲液交替时 （3）容量受样品体积的限制 （1） 吸附剂比较廉价 范德华可用于大规模分离的初步分（2） 分辨率较高 物理吸离 30％ （3） 选择时试验工作附 适合小分子的分离纯化 量大 共价键（1）选择性好 作用 适合含硫醇蛋白质的分离纯不多 化