艾滋病病毒感染者及艾滋病患者CD4+T淋巴细胞检测质量保证指南
第五章 室内质控
5.1仪器质控
5.1.1 仪器应按照生产厂家的要求进行校准。正式检测样品前应先用仪器生产厂家的质控品校准仪器，质控品通过测试后方可检测样品。
5.1.1.1 通常仪器设置应当按照仪器生产厂家的要求用商业化的校准物质(如荧光微球)校准流式细胞仪并建立档案,保存记录并监测流式细胞仪的性能变化(电压,放大,补偿)。 5.1.2设置分析窗口
5.1.2.1 依据试验所用荧光单克隆抗体所带荧光素选择对应的通道，建立分析窗口。专门设置的分析窗口取决于流式细胞仪荧光性的范围通道特性与所使用的抗体组合。分析窗口的荧光范围由相应通道的特性决定。设计分析窗口在特定设置情况下，通过流式检测的荧光范围。 5.1.2.2 目的是可以达到荧光范围的重复性和细胞群位置的标准化 5.1.2.3 使用荧光微球作为参考标准。
5.1.2.4 收集每个通道的信号作为靶标，记录保存建立的分析窗口为以后分析所用。 5.1.2.5 再开机检测时用此靶值作为标准值，调节PMT电压，得到同一窗口进行样品分析。 5.1.2.6 每天对电压做Levey-Jenning图。
5.1.3 每日应校正光路，确保所有的参数都有最明亮最窄的峰。
5.1.4 进行多色分析时，颜色补偿通常由自动软件完成，自动补偿一般情况下会运行很好。通常在一至两个月中定期设置一次荧光补偿。如果变异系数(CV)有较大变化或在样品获取时出现问题要及时进行调节或校准(见图3)。在某些情况下推荐手动补偿，例如：需确认现有光学滤镜与新的荧光剂的兼容性。手动补偿即是将每一抗体在单独的试管中与正常人阴性血样结合进行每一种单一抗体的补偿，然后混合单色的样品，依照仪器生产厂家要求设置色补偿。
5.1.5 使用多色试剂( 三色和四色)，可用仪器质控软件成功运行后自动生成的仪器设置文件内的荧光补偿。强力推荐每1-2个月使用正常人全血，对每一通道进行补偿和电压调节。使用单色试剂，需要调用上述文件后，依据样本情况和图4的补偿原理进行优化。 5.2 过程质控 5.2.1试剂质控
5.2.1.1 所用试剂应在有效期内。
5.2.1.2 使用不同批号试剂时，需要进行平行实验。即新批号试剂在测定质控品(已知细胞数
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的商业质控品)时能够获得与原试剂相同的结果。
未补偿 补偿不足 正确补偿 A1–A3分布图，分别显示实验图。B1–B3是A1–A3相对应的示意图
图3 多色补偿图
此图引自《用CD45设门的单平台法检测人类免疫缺陷病毒（HIV）感染者的CD4＋T淋巴细胞实验操作指南（2003年版）美国ＣＤＣ》
5.2.1.3 对于同批试剂，应采用HIV阴性全血样品作为定值指标。
5.2.1.4 用CD45设门进行CD4+T淋巴细胞检测。对于不能测定进样体积的流式细胞仪，非测量体积获得细胞数的仪器，必须用微球计数T淋巴细胞各亚型的绝对数。 5.2.2样品质控 5.2.2.1样品采集
a)抗凝管的准备和标记：选择含有固态抗凝剂（KEDTA）的采血管(2ml或5 ml)作为血样采集管。应保证采血量达到但不超过抗凝管容积的水平，以保证抗凝剂的最终有效浓度。尽可能采用真空管，避免使用注射器采集血样。将被检者ID号标签贴于抗凝管上，并在CD4+T淋巴细胞检测样品发送/接收单上注明采样日期和时间(见附表1)。
b)采血时间：鉴于CD4+T淋巴细胞数日间自然变化的个体差异，每一病人采样时间应尽可能集中在某个相同的时段。如：每次采样时间均在上午或均在下午。
c)采样量：成人采集静脉血5ml，采集儿童静脉血样品建议用儿童型注射器和小试管(2ml)，采集婴儿样品较为困难，用小试管采集0.5-1ml即可。所有血样应立刻注入事先加入适当抗凝剂的试管。
d)样品混匀：采集的静脉血注入抗凝管后，立即轻轻颠倒抗凝管6-8次，使血液与抗凝剂充
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分混匀，防止血液凝固。
e)影响因素: CD4+T淋巴细胞水平会受到一些因素的影响，采血前应了解患者的状况。服用肾上腺皮质激素，急性病毒感染以及术后病人等均不宜采血。参见病人用药和疾病情况可能影响CD4+T淋巴细胞检测结果简表（附表2）。 5.2.2.2样品运输
a)安全运输样品：按照国务院“病原微生物实验室生物安全管理条例”和国际传染病物质航空运输的标准，进行三层包装。参见《全国艾滋病检测技术规范（2004年版）》。 b)样品运输条件：37℃以上的温度会破坏细胞，使血液学和流式仪的检测结果受到影响。在室温（18-25℃）保存和运输样品，避免极端温度（结冰或大于37℃）。高温季节，需用隔热容器盛装样品，并将其置于有冰袋和吸热物质的容器中。如样品不能立即送达实验室或送到后不能立即检测，应存放于室温，不得冰冻保存。特殊情况下按要求保存和运输。 c)样品运输条件：样品应在48小时之内送达检测实验室。 5.2.2.3样品接收和贮存
a)样品接收：检测实验室应指定专人接受样品。收到样品后，应填写CD4+T淋巴细胞检测样品发送/接收单（见附表1）。检查样品质量、数量并核对标识。溶血、凝血或结冰的样品应视为不合格样品，不可检测。如果样品较热或较冷，但没有明显的溶血或结冰，可以进行处理检测，但要在接收记录以及结果报告表上详细注明接收时不正确的温度条件或存在溶血的程度。
b)样品贮存：样品到达后，应及时进行处理，如不能马上处理，应在室温（18-25℃）保存，避免极端温度（结冰或大于37℃）。样品应在采集后72小时内完成检测。 5.2.2.4样品处理
样品的处理和分析应遵循有关标准操作程序(SOP)，并需注意下列要点：
a) 吸液: 吸液不准确是导致检测错误的最常见原因。检测前，实验人员必须经技术培训，并接受周期性测评。移液器需定期校正(见附件1)。
b) 混合: 处理样品时，应充分混合样品和试剂，再移至上样管。 c) 应采用免洗法进行样品处理。
d) 所有加入抗体后的试管应避光，并按规定的时间进行孵育。
e) 经染色处理的样品应用含有多聚甲醛的固定剂(PFA)固定。以保证样品稳定并使HIV灭活。
f) 样品固定30分钟后方可上机检测，若不能即刻检测，应将染色样品储存于4-10℃冰箱。已经加入荧光微球的样品应在6小时内上机检测。如不能按时上机检测，荧光微球须在检测
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前加入。检测时间必须遵循不同仪器的相关标准操作程序。 5.2.2.5样品分析
a)样品分析应遵循与仪器相应的标准操作程序(SOP)。
b)如果利用CD45单克隆抗体和侧向光设门(见图4)，可检测放置72小时的样品，并可用于检测6岁以下儿童CD4+T淋巴细胞占淋巴细胞总数的百分率。
c)每份待检样品应保证收集足够的T淋巴细胞数（至少2000-2500个）。分析所收集到的荧光微球，至少要大于荧光球的数目。通过分析所收集到的荧光微球量计算CD4+和CD8+T淋巴细胞的绝对数量。 5.2.2.6每日质控
a)稳定的全血样品可用于室内质控。在CD4+T淋巴细胞测定过程中，同时使用室内质控品，可帮助分析和判断仪器的准备和分析是否均处于最佳状态。 b)实验室需绘制每日质控图。
c)每日质控图应由参加CD4+T淋巴细胞检测的工作人员绘制。绘制质控图(Levey-Jenning)均值和标准差来自商用质控品或CDC提供的质控品。该质控品提供CD4+T淋巴细胞数的均值和标准差。 实验室将每次测定的CD4+T淋巴细胞计数点在上述质控图内。实验者必须检查各点是否在2倍标准差之内。使用该图的目的是每日检查实验质量，发现并及时改正不良操作。此外，当改用不同厂家试剂或改变质控品时须重新绘制质控图(Levey-Jenning)。 5.2.3数据质控 5.2.3.1数据分析
a）用高亮度的CD45和低亮度的侧向散射光确定淋巴细胞。用CD45设门确定淋巴细胞的单平台(SPT)分析方法如图4所示。
b）对淋巴细胞进行设门时，单核细胞不能超过3％，设门不能过小，应保证门内有97%以上的淋巴细胞。 5.2.3.2结果报告
a）结果报告时间及复检：按照报告单内容填写结果，接受样品后72小时之内出具CD4+T淋巴细胞检测结果报告。CD4+T淋巴细胞检测结果报告单应由检测者和主管共同签字。见附表三。 b）正常值范围：成人和儿童的参考范围应该由国家或省市级实验室制定，结果报告单中应附有参考范围（例如，CD4+T淋巴细胞绝对数和百分数）。
c)各项检测指标的含义：CD4+T淋巴细胞是T辅助淋巴细胞。报告该值的正确细胞是CD3和CD4全部双阳性的细胞，未使用CD3抗体时，正确细胞应是高表达CD4受体的细胞。同样，CD8+T淋巴细胞是T抑制淋巴细胞/细胞毒细胞和CD3,CD8都为阳性的细胞。在识别CD4和CD8中应不包括
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其他细胞型别的非T淋巴细胞。 5.2.3.3 数据储存
a)尽可能对所有分析过的样品都存储成原始数据文件(data file)格式，这样可以对原始数据进行分析。
b)保留所有的原始文件、报表和报告。保存期至少两年，或按照当地政府或有关部门规定要求保留更长的时间。数据可以电子版存放。保存期限过后由实验室主任决定如何处理。 5.2.3.4可靠性分析
CD3+CD4+%与CD3+CD8+%总和等于CD3+%加减5%。两管都有CD3的三色试剂检测CD3+CD4+与CD3+CD8+T淋巴细胞时变异性应小于等于2%。用新方法或改变操作者时建议每一个实验室应进行不少于5次重复检测和分析来确定检测的变异性。实验结果的变异性应小于10％（CD4+T淋巴细胞应大于50个细胞/ul）。
1设R1门 ( 总淋巴细胞) 2.分析R1门内细胞 (CD3+CD4+总淋巴细胞) 3. 分析R1门内细胞 (CD3+CD8+总淋巴细胞)