基因工程实验报告
学院：生命学院
班级：生技092
学号：
姓名：
基因工程实验技术
目录
实验一、动物组织RNA提取
实验二、RT-PCR扩增目的基因cDNA 实验三、核酸琼脂糖电泳分析 实验四、质粒的提取
实验五、表达载体和目的片断的酶切 实验六、载体和外源DNA的连接 实验七、感受态细胞的制备及转化 实验八、重组质粒筛选、鉴定及转化 实验九、目的基因诱导表达 实验十、Western Blotting 检测 附录1 DNA的纯化与回收 附录2 培养基制备和细菌培养 附录3 小鼠β-actin基因序列 附录4 表达载体pGEX 4T-1图谱
小鼠β-actin基因的克隆与表达
实验流程图
小鼠肝脏 总RNA提取 RT-PCR扩增 ?－ actin 基因 片段胶回收 表达载体构建 表达菌株转化 诱导表达
Western 杂交
小鼠β-actin基因的克隆与表达
1 动物组织mRNA提取
（Trizol法）
1.1试验原理：
RNA是基因表达的中间产物，存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物
学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA 是很多分子生物学实验所必需的，如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败，在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在，所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂，迅速破坏细胞结构，使核蛋白与RNA分离，释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心，使RNA与其他细胞组分分离，得到纯化的总RNA。在提取的过程中要抑制内源和外源的RNase活性，保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂，如DEPC是RNase的强抑制剂，常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂，也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。
1.2材料
小鼠肝脏或肌肉组织。
1.3 仪器设备
高速冷冻离心机、低温冰箱、核酸电泳设备、液氮罐、研钵、剪刀、镊子、电泳仪系统、凝胶成像系统等
1.4试剂配制及器具处理
1、0.1％的DEPC H2O（DEPC：焦碳酸二乙酯）
2、器具处理：试剂瓶、量筒、研钵、大小枪头和1.5ml和0.2ml 的EP管等用纱布包裹，在0.1％的DEPC H2O中浸泡过夜（37℃），高压灭菌，80℃烘干备用。剪刀、镊子和药匙等160℃烘烤6h以上。
3、无RNA酶灭菌水（DEPC H2O）：用将高温烘烤的玻璃瓶装重蒸馏水，按0.01%（体积/体积）加入的DEPC处理过夜，拧松瓶盖，高压灭菌。80℃烘4h以上。 4、Trizol
5、75%乙醇：用新打开的无水乙醇和DEPC处理过的水配制75%乙醇（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。 6、氯仿 7、异丙醇
8、 TAE缓冲液（50×）：用时需稀释50倍 9、 点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油
10、 溴乙啶染色液(EB)：10mg/ml溴乙啶。注意：EB具致癌作用。 11、 琼脂糖
1.5 操作步骤
1.5．1 Trizol法提取总RNA
① 先在研钵中加入液氮，再将组织剪成小块在液氮中磨成粉末，用液氮预冷的药匙取50～100mg组织粉末加入已盛有1ml的Trizol液的EP管中（注意组织粉末总体积不能超过所用Trizol体积的10%），充分混合均匀。
② 室温放置5min，然后加入200μl的氯仿，盖紧EP管并剧烈摇荡15秒钟。
③ 12000rpm离心10min，取上层水相于一新的EP管中（千万不要将中间的沉淀层和下层液混入，否则重新离心分离），加入500μl异丙醇，温和颠倒混匀。室温放置10min，12000rpm离心10min。
④ 小心地弃去上清液，加入1ml的75%乙醇，涡旋混匀，4℃下12000rpm离心5min。 ⑤ 重复步骤④。
⑥ 弃去上清液（尽量将残余液体除去），室温或真空干燥5～10min（注意不要干燥过分，否则会降低RNA的溶解度）。用30μl DEPC处理过的水将RNA溶解，必要时可55℃～60℃水浴 10min。RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注]
① 整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
② 加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
试剂作用：
Trizol： Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀
浆和裂解过程中，能在破碎细胞、降解细胞其它成分的同时保持RNA的完整性。在氯仿抽提、离心分离后，RNA处于水相中，将水相转管后用异丙醇沉淀RNA。用这种方法得到的总RNA中蛋白质和DNA污染很少，可以用来做Northern,RT-PCR,分离mRNA，体外翻译和分子克隆等。
DEPC：DEPC是RNA酶的强烈抑制剂，凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用
0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。Tris溶液可用DEPC处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。
氯仿： 氯仿是分子量比较大的有机溶剂，在提取RNA时，氯仿可以有效的使有机相和无
机相迅速分离。DNA提取过程 有机相中主要是酚和蛋白结合，从而使得蛋白和DNA脱离，DNA进入水相。但是在RNA的提取过程就要避免蛋白和DNA脱离，否则DNA会释放到水相。不管有酚也好，没有酚也好，氯仿本身也对蛋白有变性