台式离心机、PCR扩增仪、电泳仪系统、恒温水浴箱，培养皿、带帽试管、涂布器、冷冻离心机、无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）、恒温摇床，台式离心机、恒温水浴、微量移液器
8.3重组质粒提取
8.3.1 提取质粒测定
待转化的细菌菌落长直径到2mm时，用接种针（或用灭菌的牙签、小枪头）挑取单克隆菌落，在对应编号的培养管中接种，培养管中含5ml LB液体培养基。
8.4重组质粒鉴定
8.4.2 菌落PCR快速鉴定法
直接用接种针或牙签挑取少许菌体加入20μl的PCR反应体系中。
试剂 克隆引物B1 克隆引物B2 菌液(单菌落) 2×mix
用特异引物进行菌落PCR，电泳检测PCR产物，挑选对应的阳性克隆菌落。 8.4.2重组质粒酶切鉴定
8.4.2.1 重组质粒提取
挑取菌落PCR鉴定的阳性转化产物，进行活化和扩培（参见附录2）后提重组质粒， 重组质粒提取
1．取1.5-4.5ml过夜培养的菌液，9000rpm离心30秒，弃上清，收集菌体，尽可能倒干上清。超过1.5ml菌液可以离心弃上清后，在同一个1.5ml管内加入更多菌液，重复步骤1，直到收集足够菌体。
2．用250ul溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮。
如果有未悬浮的菌块，会影响裂解，导致提纯量和浓度偏低。
3．加250ul溶液P2，温和地上下翻转6-10次使菌体充分裂解，直到溶液变得清亮。 温和地混合，不要剧烈震荡，以免基因组DNA剪切断裂！所用时不应超过5分钟！以免质粒受到破坏。此时菌液应变得清亮粘稠，若菌体少，很快清亮粘稠后就可以做下一步。 4．加400ul溶液P3，立即温和地上下翻转6-10次，室温放置5分钟。13,000rpm离心10分钟，小心取上清。
5．将吸附柱置于收集管上，加入500ul溶液P4，13,000rpm离心1分钟，弃滤液。将 4步所得上清加入吸附柱AC中（吸附柱放入收集管中），13,000rpm离心1分钟，弃滤液。 6、加入500ul去蛋白液PE，13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。
此步骤除痕量核酸酶等杂质，如所用菌株为JM系列、HB101等endA菌株或野生型菌株，核酸酶含量丰富，应加此步骤；如果所用菌株为XL-1Blue和DH5α等缺陷型菌株，核酸酶含量低，则可略过此步骤。
7、加入500ul漂洗液WB（请先检查是否已加入无水乙醇！），13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。
8、重复步骤7一次，13,000rpm离心30-60秒，弃滤液。空柱13,000rpm离心2分钟。室温放置3-5分钟，除去残留乙醇。
体积（20μl） 1μl 1μl 1μl 0.5μl
9、取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管仲，在吸附膜中间部位加50-100ul洗脱缓冲液EB（洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴加热效果更好），室温放置1分钟，12000rpm离心2钟洗脱DNA，可立即用于下游分子生物学实验活-20℃保存。
洗脱体积越大，洗脱效率越高，如果需要质粒浓度较高，可以适当减小洗脱体积，但是最小体积不应少于50ul，体积过小降低质粒洗脱效率，减少产量。 按下表将各种试剂分别加入每个200μl的EP管中，注意管号。
试剂 质粒DNA SalⅠ BamHⅠ Buffer（10×） BamHⅠ ddH2O 体积（20μl） 13μl 1μl 2μl 0.5μl 3.5μl 加样后混匀，置于37℃水浴中，保温3~4h。然后每个管中加入4μl Loading buffer终止反应。
电泳检测重组质粒酶切产物，挑选对应的阳性克隆菌落的管号，进行电泳纯化回收。
8.5 重组质粒转化
用重组质粒转化表达菌BL21（DE3）PlysS，参考7.4.2。
8.5.1感受态的制备
① 从LB平板上挑取单克隆于5ml LB培养基中，37℃ 200rpm摇菌12～16h。 ② 将活化过的菌按1～5％的体积比接种到新的LB液体培养基中，37℃ 200rpm摇菌约2h，OD600约为0.4。
③ 取1.5ml摇好的菌液于一1.5ml的EP管中，4℃ 4000rpm离心3min，弃上清。 ④ 加250μl 0.1M CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，4℃ 8000rpm离心1min弃上清。
⑤ 加100μl 0.1M的CaCl2（灭菌预冷）温和悬浮菌体，即为感受态细胞。置于4℃ 存放。12h内使用效果最佳。
[注]
① 无菌操作和保持低温。
② 培养物处于对数生长期是制备感受态细胞的关键。
③ 如果要求高转化效率，不建议使用简单深冻保存的感受态细胞。 7.4.2转化
① 将盛有感受态细胞的EP管放置于冰上10min，加入10μl连接产物（若加质粒，则只需加1μl），温和混匀，冰浴20~30min。
② 42℃热激90S。冰浴5~10min。 ③ 加入1000μL LB液体培养基，37℃培养45～60min。4000rpm离心2min，弃去800μl上清液，剩余混匀用来涂板。
④ 取含有50～100μg/ml Amp的LB平板培养基，均匀涂板后正置5~10min。 ⑤ 37℃倒置培养16~20h。
8.6载体和外源DNA的连接
6.3.1操作步骤
表达载体与目的片断的连接
取一个200μl的PCR管依次加入下列试剂：
pGEX 4T-1酶切回收产物： 2μl 酶切回收的目的基因片段： 6μl
10×buffer： 1μl T4连接酶： 1 μl
离心30Sec，使反应体系充分混合，4℃连接过夜或（16℃连接4h；22℃连接2 h）。
8.7图片分析
Mark 重组质粒 重组质粒 质粒
菌落PCR
分析：重组质粒转入克隆细胞后，重组质粒大量克隆，进行菌落PCR，克隆细胞裂解后重组质粒渗出，可以跑出条带，另外在点样时可以用重组质粒，质粒做对照，质粒比重组质粒要少一段目的片段，跑得要快点，位置稍微靠前。有的带条不明显或是没有条带，可能是重组质
粒的转化率不高，菌落PCR没有扩出足够的重组质粒。
质粒 目的片段
重组质粒酶切
分析：为了检测转化后的菌落是否出现假阳性，将转化后的重组质粒提取出来，然后双酶切，将目的片段从重组质粒上切下来，然后跑电泳，则会出现两条带，一是质粒，二是目的片段，因目的片段较小跑得快，位置靠前。但有的带条不明显或是没有条带，说明没有酶切好，可能是酶切时间不够，或是重组质粒的酶切量太少了。
9 目的基因诱导表达
9.1 诱导靶蛋白表达
分别挑取对照菌和重组菌1~2个菌落，接入5ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养过夜。
取5ml过夜培养物接入500ml含Amp（30μg/ml）的LB培养液，37℃振荡培养2h以上，至对数中期（A550=0.5~1.0）。
向诱导管中加入IPTG使其浓度达到1mmol/L，28℃振荡培养5h左右取样，进行蛋白电泳，参见10.3。
10 Western Blotting
10.1 试剂
10.1.1 细菌培养和诱导表达 ① LB液体培养基 ② IPTG ③ Amp
10.1.2 电泳试剂
① 30%丙烯酰胺溶液：Acr：29.0g，Bis：1.0g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。 ② 1.5mol /L Tris-HCl分离胶缓冲液pH8.8（4×）：取18.15g Tris，用1MHCl调pH至
8.8，加水至100ml，4℃保存。
③ 0.5 mol /L Tris-HCl浓缩胶缓冲液，pH6.8（8×）：取11.96g Tris，用1N HCl调至pH 6.8，加水至100ml，4℃保存。 ④ 电极缓冲液（pH8.3）：取14.49g甘氨酸，3.02g Tris，加100ml 10%SDS，加水至1升，4℃保存。
⑤ 10% SDS：取10g SDS，加水至100ml，完全溶解后室温保存。 ⑥ 10%过硫酸铵溶液（AP）：临用前现配。
⑦ 染色液（0.25%考马斯亮蓝R-250、50%甲醇、7%乙酸）：考马斯亮蓝R-250 2.5g、甲醇（可用无水乙醇代替）500ml、70ml冰乙酸，溶解后补足水至总体积1000ml。 ⑧ 脱色液（30%甲醇、7%乙酸）：甲醇（可用无水乙醇代替）300ml，冰乙酸70ml，补足水至1000ml。
⑨ 样品缓冲液（2×）：H2O 2.4ml，浓缩胶缓冲液1.0ml、甘油0.8ml、10% SDS 3.2ml，2-硫基乙醇0.4ml，0.025%（W/V）溴酚兰0.2ml。 ⑩ TEMED（四甲基乙二胺） 10.1.3 转移和杂交试剂
① 转移缓冲液：3.03g Tris、14.4g的Glycine、200ml甲醇、定容到1L。 ② TBS：0.1M的Tris、0.9%的NaCl、pH 7.5 ③ TTBS：TBS中含0.1%的Tween-20 ④ 预染的蛋白marker ⑤ 硝酸纤维素膜 ⑥ 脱脂奶粉
⑦ anti-GST单克隆抗体
⑧ goat-anti-mouse-IgG-HRP（HRP，horseradish peroxidase，辣根过氧化物酶） ⑨ 3,3’diaminobenzidine（DAB，二氨基联苯胺） ⑩ DAB增强剂
10.2 设备
离心机、电泳设备、电转印设备、摇床
10.3 电泳
① 准备步骤
将凝胶板水洗涤干净，然后使其自然风干或烘干。梳子临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。安装玻璃板、板条，并将玻璃板固定在灌胶架上。
按下表配制适合浓度的分离胶，摇匀后迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，小心在胶上覆盖一层95%的乙醇。
H2O
29?r+1%Bis 4×分离胶缓冲液(pH8.8)
10% SDS TEMED 10%过硫酸铵
总体积
10%(ml) 4.10 3.34 2.50 0.05 0.02 0.02 10ml
在分离胶聚合的过程（约30min）中，配制5%浓缩胶，TEMED应在灌胶前才加入。