蛋白吸附容量 （毫DEAE－ 形状 纤维素 度 量 （mg当量（微米） /g） 长交换当克/克） 胰岛牛血清床体积（毫升/克） 清蛋白素（pH8.5） （pH8.5） 750 750 850 850 溶菌酶 450 660 660 450 8.3 6.0 6.0 pH6.0 pH7.5 改良纤维DE-22 性 * DE-23 DE-32 DE-52 12~400 18~400 0.1 1.0±7.7 9.1 6.3 6.3 7.7 同上（除细粒） 24~63 微粒性（干粉） 24~63 同上（溶胀） 12~400 18~400 1.0±0.1 1.0±0.1 1.0±0.1 7S－γ球蛋pH5.0 pH7.5 7.7 9.1 6.7 6. CM－纤维素 CM-22 CM-23 CM-32 CM-52 改良纤维性 (pH5.0) 白（pH5.0） 600 150 150 400 400 7.7 9.1 6.8 6.8 0.6±0.06 600 0.6±0.06 1,260 1.0±0.1 1.0±0.1 1,260 改良纤维性（除24~63 细粒） 24~63 微粒性（干粉） 微粒性（溶胀） （二）离子交换层析 蛋白质进入离子交换柱后，与离子交换树脂无亲和力的蛋白质被洗脱下来。余下的蛋白质均结合在树脂上，利用其蛋白质表面电荷性质的不同，与树脂的亲和力也各不相同，利用不同强度的离子溶液，将其分别洗脱下来达到分离、纯化蛋白质的目的。
以下对操作过程的要点进行说明。 1. 离子交换剂预处理和装柱
对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带 H + 或 OH - 的交换剂型。阴离子交换剂常用 “碱 -酸-碱” 处理，使最终转为-OH -型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用 “酸- 碱-酸” 处理，使最终转为-H -型交换剂。洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的 pH 和离子强度。已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。
2. 加样与洗脱
加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的 pH 和离子强度，所选定的 pH 值应落
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在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的 1％－5%。加样蛋白浓度低于20 mg/mL，上样体积小于柱体积的1/3 。
洗脱：已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的 pH 或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变 pH 与离子强度。为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变 pH 或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同 pH 与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。由于这种洗脱 pH 与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。最好的洗脱方法是连续梯度洗脱：两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定 pH 的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同 pH 的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。第一容器中某一时间的盐浓度可用下式进行计算： C ＝ C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1 式中 A 1、A 2分别代表两容器的截面积： C1、C2分别表示容器中溶液的浓度； V 为流出体积对总体积之比。当 A 1 ＝A 2 时为线性梯度，当A 1＞A 2时为凹形梯度， A1＞A2 时为凸形梯度。 进行离子交换层析的最佳洗脱 溶液 pH 值一般与预分离蛋白质的等电点相差一个单位。这使蛋白质的净电荷量能保证将其结合在离子交换树脂上，又不需在洗脱时采用高强度的离子浓度或 pH 值相差悬殊的苛刻的洗脱条件。
洗脱时应满足以下要求： ① 洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不致太拥挤。 ② 梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。 ③ 梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。目的物过早解吸，会引起区带扩散；而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。 ④ 流速： 1 mL/cm 2 · min ，过快会吸附不完全，分离不清，洗脱峰平坦。
3. 洗脱馏份的分析
按一定体积（ 5-10 mL/管）收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法（生物活性测定、免疫学测定等）确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。
4. 离子交换剂的再生与保存
离子交换剂可在柱上再生。如离子交换纤维素可用 2 mol/L NaCl 淋洗柱，若有强吸附物则可用 0.1 mol/L NaOH 洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为： 0.5 mol/L NaOH- 水 - 乙醇 - 水 -20 % NaOH-水。保存离子交换剂时要加防腐剂。对阴离子交换剂宜用 0.002 % 氯已定（洗必泰），阳离子交换剂可用乙基硫柳汞（ 0.005％）。有些产品建议用 0.02％叠氮钠。
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离子交换层析法是以具有离子交换性能的物质作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。
实验四 酶活力及蛋白质浓度的测定
一 、实验目的
1.学习考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）法测定蛋白质浓度的原理和方法 2．掌握比色法测定溶菌酶的酶活 二、实验原理
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白
浓
度的快速、灵敏的方法。
考马斯亮蓝G―250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。它和蛋白质通过范德华力结合，在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律（Beer’s law）。此染料与蛋白质结合后颜色有红色形式和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
蛋白质和染料结合是一个很快的过程，约2min即可反应完全，呈现最大光吸收，并可稳定1h，之后，蛋白质―染料复合物发生聚合并沉淀出来。蛋白质―染料复合物具有很高的消光系数，使得在测定蛋白质浓度时灵敏度很高，在测定溶液中含蛋白质5μL/ml时就有0.275光吸收值的变化，比Lowry法灵敏4倍，测定范围为10－100μg蛋白质，微量测定法测定范围是1－10μg蛋白质。此反应重复性好，精确度高，线性关系好。标准曲线在蛋白质浓度较大时稍有弯曲，这是由于染料本身的两种颜色形式光谱有重叠，试剂背景值随更多染料与蛋白质结合而不断降低，但直线弯曲程度很轻，不影响测定。
此方法干扰物少，研究表明：NaCl，KCl，MgCl2，乙醇，（NH4）2SO4无干扰。强碱缓冲液在测定中有一些颜色干扰，这可以用适当的缓冲液对照扣除其影响。Tris，乙酸，2―巯基乙醇，蔗糖，甘油，EDTA及微量的去污剂如Triton X―100，SDS，玻璃去污剂有少量颜色干扰，用适当的缓冲液对照很容易除掉。但是，大量去污剂的存在对颜色影响太大而不易消除。
三、实验试剂与器材
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考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50ml95%乙醇中，加入100ml85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml，滤纸过滤。最终试剂中含0.01%(W/V)考马斯亮蓝G―250，4.7%(W/V)乙醇。
标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/LNaCl配制成1mg/ml，0.1mg/ml蛋白溶液。
未知蛋白质溶液，试管及试管架， 移液管，UV－2000型分光光度计。 四、实验操作方法 (一) 标准法制定标准曲线
（1）取14支试管，分两组按下表a平行操作。分别加入样品、水和试剂，即用1.0 mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 ml，然后用无离子水补充到0.1 ml。最后各试管中分别加入5.0 ml考马斯亮兰G-250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。 （2） 加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光吸收值A595。
(3) 绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。由此标准曲线，根据测出的未知样品的A595值，即可查出未知样品的蛋白质含量。 (0.5 mg牛血清蛋白/ml溶液的A595约为0.50)
表a 试管编号 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 考马斯亮蓝试剂/ml 0 0 0.1 1 0.01 0.09 2 0.02 0.08 3 0.04 0.06 5ml 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
每管中蛋白质含量（mg） A595nm 4 0.06 0.04 5 0.08 0.02 6 0.1 0.00 (二) 微量法制定标准曲线
取12支试管，分两组按下表b平行操作。
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，绘制标准曲线。
表b
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试管编号 1mg/ml标准蛋白溶液/ml 0.15mol/L NaCl/ml 考马斯亮蓝试剂/ml 0 0 0.1 1 0.01 0.09 2 0.02 0.08 5ml 3 0.03 0.07 4 0.04 0.06 5 0.05 0.05 摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
A595nm (三) 未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/ml）。 （四）溶菌酶的活性测定
（1）酶液配制：准确秤取溶菌酶5mg,用0.1mol/L,pH6.2 磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50μg/ml。
（2）底物配制：取干菌粉5mg加入上述缓冲液少许，在研钵中研磨2Min,倾出，稀释到15-25ml。
（3）活力测定：先将酶和底物分别放入25℃水浴中预热10min，吸取底物悬浮液4ml放入比色杯中，在450nm出测吸光度，然后吸取酶液0.2ml，测定30s和5min30s的吸光度。以平均每分钟光密度下降0.001作为一个活力单位（由于溶菌酶对小球菌细胞壁的降解做用导致光密度的降低）。计算方法如下： 酶活性 （U）=（ODt0-ODt1）*1000*A,
其中ODt0为30s时的光密度，ODt1为5Min30s时的光密度;A为酶的稀释倍数，酶活性为每毫克冻干溶菌酶所具有的活性单位。 注意事项
（1） 如果测定要求很严格，可以在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
（2） 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，实验证明此复合物的吸附量是可以忽略的。测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
实验五 溶菌酶纯度鉴定与分子量测定
一、实验目的
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