1. 学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）测定蛋白质纯度与分子量的原理 2. 掌握SDS－PAGE垂直板电泳分离蛋白质技术 3. 运用SDS-PAGE测定蛋白质分子质量及染色鉴定 二、实验原理
PAGE电泳是根据蛋白质分子（或其它生物大分子）所带电荷的差异及分子大小的不同所产生的不同迁移率而分离成若干条区带。然而有时两个分子量不同的蛋白质，由于其分子大小的差异、被它们所带电荷的差别补偿而以相同的速度向阳极移动，因而不能达到分离的目的。SDS-PAGE就是设法将电荷差异这一因素除去或减小到可以略而不计的程度。
SDS是一种阴离子表面活性剂，能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合蛋白质疏水部分，形成SDS-蛋白质复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/1g蛋白质。由于SDS带有负电荷，使各种SDS-蛋白质复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质分子原有的电荷差别。这样的SDS-蛋白质复合物在凝胶电泳中的迁移率不再受蛋白质原有的电荷和形状的影响，而只与蛋白质的分子量有关。
当蛋白质的分子量在15000～200000之间时，电泳迁移率与分子量的对数值呈直线关系，符合下列方程： 1gMr =K―bmR
式中：Mr为蛋白质的分子量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁移率。在条件一定时，b和K均为常数。
若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量的对数作图，可获得一条标准曲线。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。
三、实验试剂与器材
垂直板型电泳槽，直流稳压电源，电炉，脱色摇床， 50或100μl微量注射器、玻璃板、水浴锅，染色槽，烧杯，吸量管，常头滴管等
蛋清（S1）、粗分离样品（S2）、离子交换层析中穿透峰下降段样品（S3）、离子交换层析洗脱峰样品（S4），橡胶手套；2×上样缓冲液、10%SDS、30%丙烯酰胺贮存液、分离胶缓冲液（1.5 mol/L pH8.8 Tris-HCl 缓冲液）、浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L pH6.8 Tris-HCl 缓冲液）、10%过硫酸铵(AP)、TEMED、pH8.3 Tris-Gly电泳缓冲液、1%琼脂糖溶液、染色液、脱色液
四、实验内容与步骤 （一）蛋白样品的处理
取200μL 上述备用蛋白样品于带塞的小离心管中，加入200μL 的2×上样缓冲液，混
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匀，轻轻盖上盖子，封口膜封紧瓶口以免加热时迸出，在100℃沸水浴中加热3～5min，取出后10000r/min 离心10min，取上清待用。 （二）SDS-PADE实验步骤
1．电泳玻璃板洗净，并把玻璃板在灌胶支架上固定好。( 试样格（梳子）临用前用无水乙醇擦拭，让其挥发至干。)
2．用电泳缓冲液配制1%的琼脂糖凝胶，煮沸溶解后冷却至55℃左右，加入制板槽槽内封板。（固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板.）
3．按比例配好分离胶，用移液管快速加入，大约5cm左右，之后加少许蒸馏水，静置30分钟。（凝胶配制过程要迅速, 催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶.注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡。水封的目的是为了使分离胶上延平直，并排除气泡。凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。）
4．倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干，按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至离边缘5mm处，迅速插入样梳，静置25分钟。（样梳需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平。）
5．拔出样梳后，在上槽内加入缓冲液，没过锯齿时可拆去底端的琼脂糖。（要使锯齿孔内的气泡全部排出,否则会影响加样效果.）
6．加样5个，空出第一个孔，从第二个开始按已编排好的顺序依次加入相应体积的样品和蛋白Marker。其中蛋清（S1）和Marker加样量为2μL，S1、S2、S3、和S4加样量为10μL。为了练习和比较上样量的影响，可以加20μL的S1～S4作为对照（注射器不可过低,以防刺破胶体,也不可过高,在样下沉时会发生扩散。为避免边缘效应，最好选用中部的孔注样。） 7．电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，开始电压恒定在160V，当进入分离胶后改为240V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。
8．凝胶板剥离与染色：电泳结束后，用专用工具撬开短玻璃板，从凝胶板上切下一角作为加样标记，然后放在大培养皿内，加入染色液，42℃染色40min左右。（剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分。）
9．脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰。 即用直尺分别量取各条带与凝胶顶端的距离。 附表1 浓缩双蒸水 0.5mol/L pH6.8 Tris-HCl 6.1mL 2.5mL 1.3mL 16
胶贮液 10%SDS TEMED 10%AP 胶 （10mL） 4% 100μL 10L μ100μL
附表2 分离双蒸水 1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl 6.6mL 汇总所有实验结果，完成下表：
样品 体积 蛋白浓 mL 度mg/mL S1 S2 S4 其中：总活力＝比活力×体积
回收率＝回收的样品活力占总活力的百分数 提纯倍数＝提纯的比活力与初始比活力的比值 六、问题和思考
1．在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么? 2．电极缓冲液中甘氨酸的作用?
3．在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用? 4．样品液为何在上样前需在沸水中加热几分钟? 七、注意事项
1．N,N’-亚甲双丙烯酰胺为神经毒性物质，可经皮肤直接吸收，使用时应避免其直接接触皮肤，必要时应戴手套。但其凝固后就变成无毒物质。
2．安装电泳槽时要注意均匀用力旋紧固定螺丝，避免缓冲液渗漏。 3．用琼脂(糖)封底及灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。
4．加样时样品不能超出凹形样品槽。加样槽中不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头
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胶贮液 10%SDS TEMED 10%AP 胶 （20mL） 12% 5mL 8mL 200μL 8μL 200μL 总蛋活力比活力总活回收提纯倍数 白 Mg u/mL u/mg 力 U 率 % V1= V2= V4= 100 1
挑除。
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