四、年度计划
研究内容 预期目标 1. 建立多潜能干细胞和胰肾干/祖细胞的表达谱，表观遗传学信息库； 2. 建立胚胎干细胞、间充质干细胞、胰岛祖细胞，肾祖细胞的小RNA的差异表达谱；筛选出5-10个对干细胞的自我更新与定向分化具有生物功能的小RNA。 3. 建立ESC、MSC和胰肾干/祖细胞在小动物中的分子影像监测技术，应用于糖尿病和肾病的细胞治疗。 4. 建立胰腺干祖细胞及肾脏祖细胞移植与定向诱导分化的方法与技术体系。 1. 利用组学技术比较两种来源多能性干细胞的全基因组表达谱、microRNA表达谱、DNA甲基化和关键组蛋白修饰在全基因组范围的调控序列谱，分析调控细胞多能性状态及向胰肾干/祖细胞的分化过程中的分子第 调控网络和关键表观遗传状态改变。 2. 研究多能干细胞/间充质干细胞的自我更新与定向分化为胰岛祖细胞和肾祖细胞的细一 胞模型及关键转录因子功能分析平台；研究胚胎干细胞、间充质干细胞、胰岛祖细胞，构建关键 肾祖细胞之间的小RNA表达差异，的差异表达小RNA文库，完成小RNA高表年 达或抑制的高通量转染。 3. 初步建立多功能的报告基因系统。 4. 建立胰腺干祖细胞及肾脏祖细胞体外培养、扩增、移植、迁移、分化和发挥功能的技术平台与技术评价体系。
研究内容 预期目标 1. 建立胰肾干/祖细胞群体的分离、纯化、鉴定的方法；建立多潜能干细胞向胰肾干/祖细胞的分化体系。 2. 筛选出5-10个在多能干细胞、间充质干细胞的自我更新维持和向胰岛祖细胞和肾祖细胞定向分化相关的sRNA/miRNA分子，并通过RT-PCR, qPCR, Northern, western-blot等多种方式鉴定与验证这些小RNA的靶基因。筛选出与干细胞自我更新及定向分化相关的sRNA/miRNA分子。 3. 创建新型功能报告基因系统，建立ESC、MSC和胰肾干/祖细胞在体内向胰岛祖细胞、肾祖细胞分化的分子影像监测系统。 4. 建立诱导分化的技术平台与鉴定体系；明确诱导分化的分子机制。 1. 观察端粒维持相关蛋白对于干细胞干性维持的影响，提出可能的机制。 2. 用已建立的sRNA/miRNA芯片（包括本课题自主发现的shRNAs和miRNAs）和人基因表达谱芯片，并结合新一代的高通量测序技术，筛选处于不同分化阶段的胚胎干细胞、间充质干细胞、胰岛祖细胞或肾祖细胞中特异表达的sRNA/miRNA，RNA分子和DNA甲基化的差异；通过构建表达第 sRNA/microRNA（或其antisense RNA）的高效病毒表达载体库或通过化学合成间充 sRNA/microRNA瞬时转染多能干细胞、质干细胞、胰岛祖细胞和肾祖细胞，以已经二 鉴定的关键转录因子的表达变化为细胞维持自我更新与定向分化的分子指标，筛选与干 细胞自我更新及定向分化相关的sRNA/miRNA分子。 年 3. 利用报告基因系统，建立监测MSC, ESC在体内的功能；初步建立组织特异的分子成像系统。 4. 寻找肾脏祖细胞特有的标志物，建立肾脏祖细胞诱导分化为肾固有细胞的技术平台与鉴定体系，筛选调控肾脏祖细胞分化的关键因子并明确它们在诱导祖细胞向肾固有细胞分化中的分子作用机制。寻找胰腺干祖细胞特有的标志物，建立诱导分化的鉴定体系，筛选调控胰腺分化的关键因子。
研究内容 预期目标 1. 确定关键转录因子启动子区域位置，并分析得到的可能的调控因素；找到参与干细胞全能型向胰肾组织特异干祖细胞分化过程中的关键调控分子。 2. 建立小RNA, 关键靶基因和相关DNA甲基化的三维图谱以及其相互作用的调控网络；阐明表观遗传学调控对sRNA/miRNA和转录因子的影响，获得一个由表观遗传学相关因素及转录因子构成的调控向胰腺和肾脏祖细胞分化的三维分子网络。 3. 采用组织工程方法提高干细胞移植在胰/肾损伤中的疗效。制定干细胞治疗的合理移植策略，结合组织工程的方法引入水凝胶和两种细胞联合移植，提高干细胞治疗效果。 4. 建立糖尿病及糖尿病肾病的动物模型。 1. ES向胰腺干/祖细胞分化过程中启动子区域表观遗传学变化研究；microRNA的质粒转染胰腺干细胞，研究这些基因、microRNA对胰腺干细胞的影响；分析多潜能干细胞和胰肾干/祖细胞在分子调控网络和表观遗传状态的差异，选择关键的核心转录因子或表观调控分子；构建并转染筛选得到启动子驱动EGFP表达的人ESC系。 2. 研究小RNA，关键靶基因和相关DNA甲基化的相互关系。通过对处于不同分化阶段第 的胚胎干细胞、间充质干细胞、胰岛祖细胞或肾祖细胞中全基因组的甲基化的测定，确定DNA甲基化的位 （meDIP-seq 测序）点，并利用CHIP，RT-PCR和 Westerb blotting三 等多种实验方法验证相关基因的DNA甲基化变化和干细胞的自我更新与定向分化的关 系，获得关键转录因子上游的表观遗传调控因素；通过对内源性小RNA的高表达或抑年 制，以及通过siRNA对已经鉴定的小RNA的靶基因的抑制或靶基因的外源过表达，构建小RNA、关键靶基因和相关DNA甲基化的位点的调控关系，鉴定参与该DNA甲基化调控的DNA甲基转移酶以及相关的组蛋白修饰酶。 3. 通过细胞工程方法提高干细胞在微环境中粘附分子表达，减少细胞凋亡并提高细胞存活率。 4. 开展糖尿病及糖尿病肾病的动物模型研究。
研究内容 预期目标 1. 对得到的调控因素进行功能验证；用带有相关基因、microRNA的质粒转染胰腺干细胞，研究这些基因、microRNA对胰腺干细胞的影响；对得到的启动子驱动EGFP表达的人ESC系进行ES特性和相关分化特性的验证；分选细胞群用于下游相关研究；基于以上研究结果，开发新的多能干细胞向胰腺诱导分化方案。 2. 采用生物信息学方法全面深入分析和构建有关sRNA分子及其靶基因相互作用的网络系统，筛选与干祖细胞自我更新和定向分第 化有关的sRNAs，通过对生物信息学方法筛选出的相关小RNA的过表达或抑制，应用定 量RT-PCR和Western-blotting等方法检测sRNA/microRNA对转录因子表达的影响，从四 而获得能够从上游调控重要转录因子的小分子RNA；应用基因转染、敲除以及RNA干 扰、Northern blot, 探针法sRNA/microRNA荧光定量RT-PCR技术研究、验证这些小年 RNA对间充质干细胞、胰岛祖细胞，肾祖细胞自我更新和间充质干细胞向胰岛祖细胞，肾祖细胞定向分化中关键转录因子对目标sRNA/microRNA的调控作用，获得参与关键转录因子下游信号转导小RNA分子。 3. 建立ESC、MSC和胰肾干/祖细胞在体内向胰岛祖细胞、肾祖细胞分化的分子影像监测系统；将ESC、MSC应用于大动物疾病模型的治疗。 4. 开展诱导后干细胞治疗临床前安全性评价研究。 1. 明确候选关键分子在多潜能干细胞向胰肾分化过程中的生物学功能；发现与胰腺干细胞密切相关的新基因；通过对关键调控分子的干预，进一步完善多潜能干细胞向胰肾干/祖细胞的分化体系。 2. 筛选出5-10个与间充质干细胞、胰岛祖细胞，肾祖细胞的自我更新和间充质干细胞向胰岛祖细胞，肾祖细胞定向分化有关的sRNAs；综合参与转录因子上游调控和下游转导的小RNA分子，获得一个由sRNA/microRNA和转录因子构成的调控胰腺和肾脏细胞分化的二维分子网络。 3. 建立大动物的报告基因系统。 4. 建立全套诱导后细胞治疗临床前体内、外安全性评价体系。
研究内容 预期目标 1. 开发新的多能干细胞向胰腺诱导分化方案。 2. 阐述胚胎干细胞和间充质干细胞向胰和肾干/祖细胞定向分化过程中分化相关特征性sRNA/miRNA、表观遗传学修饰系统与转录因子之间相互的分子调控的三维分子网络关系；使用sRNA/microRNA病毒表达载体及化学合成的sRNA/microRNA mimic和inhibitor分别上调和下调胚胎干细胞和间充质干细胞向胰和肾干/祖细胞目标sRNA/microRNA的表达，解析分化过程特异第 的组蛋白甲基化位点、组蛋白甲基化酶和去甲基化酶以及它们复合体的组成，阐明胰腺 和肾脏细胞分化过程中sRNA/microRNA调控组蛋白、DNA表观遗传修饰的生物学模五 式；应用基因转染、敲除以及RNA干扰、化学药物等技术手段，对胚胎干细胞和间充质 干细胞向胰和肾干/祖细胞分化过程中具有重要作用的组蛋白和DNA表观遗传修饰酶年 进行干预，ChIP实验及DNA甲基化检测实验观察上述分化过程相关的特异sRNA/microRNA基因的相应组蛋白和启动子区域的表观遗传修饰的变化，从而获得特异功能性sRNA/microRNA上游的表观遗传调控因素。 3. 建立大动物报告基因和符合临床应用要求的分子影像系统。 4. 进行胰肾干祖细胞治疗糖尿病及糖尿病肾病临床前疗效评价。
1. 进一步完善多潜能干细胞向胰肾干/祖细胞的分化体系。 2. 整合并验证组蛋白和DNA的表观遗传修饰与sRNA/microRNA之间的相互调控网络关系。通过对前述三个分子调控网络的分析、总结，最终阐明在胚胎干细胞和间充质干细胞向胰和肾干/祖细胞分化过程中，以关键转录因子为核心，sRNA/microRNA和组蛋白、DNA表观遗传修饰系统参与组成的三维分子网络。 3. 提出干细胞治疗的临床疗效评价标准规范，开发出具有临床应用价值的干细胞治疗影像学评价标准化方案规范。 4. 明确诱导后胰肾干祖细胞治疗糖尿病肾病动物模型的有效性。
一、研究内容
主要研究内容包括：
1. 多潜能干细胞生物学特性和诱导分化研究：根据细胞的胚胎发育程序，以ESC和具多胚层分化潜能的成体干细胞群作为种子干细胞，定向诱导分化成胰腺干细胞和胰内分泌祖细胞；以及用来自早期中胚层细胞实现MET转分化成肾祖细胞。并对上述诱导得到的特异性标志的胰肾干/祖细胞进行生物学特性研究，并验证某些决定分化的关键性转录因子在分子网络调控中的作用及其在细胞发育特定阶段的意义。
2. 干细胞分化调控网络机制研究：以ESC、MSC、胰岛祖细胞和肾祖细胞等不同分化阶段作为研究靶细胞，确定其定向分化过程中的特异转录因子、microRNA特异性表达谱、DNA甲基化、组蛋白修饰之间的调控机制；阐明以转录因子为核心的细胞信号调控网络与表观遗传学修饰协同性调控关系，描绘出多维动态表观遗传学图谱。
3. 胰肾干/祖细胞体内生物学功能的影像学评价：综合利用生物荧光、PET及MRI在体成像技术，并结合组织切片染色和免疫组织化学等方法，检测各种细胞标志物体内分化及与宿主整合，立体重构和功能重建，为优化糖尿病移植用干细胞的筛选、活体全程组织再生修复有效性提供科学评价。 4. 胰肾干/祖细胞临床前安全性、有效性研究：干细胞治疗糖尿病及糖尿病肾病临床移植策略研究：建立糖尿病和糖尿病肾病疾病动物模型，开展体内外安全性评价，移植细胞数量、不同移植时间窗移植干细胞后对糖尿病及糖尿病肾病的临床检测指标的改善情况及糖尿病及糖尿病肾病的治疗效果，完成干细胞技术产品的临床前试验研究，为干细胞移植临床应用提供依据。