第二章 材料与方法
2.2总DNA的提取
土壤中存在着大量的腐植酸、蛋白质等杂质都将会影响以下实验步骤，而过多的纯化的步骤又会造成DNA的大量损失和DNA片段的破碎。土壤总DNA的质量直接决定实验着是否能够准确的反应微生物的实际群落组成结构，实验证明不同提取方法获得的DNA，经DGGE分析会产生不同的群落结构指纹图谱
错误！未找到引用源。
，因此选用合适的DNA 提取方法
是十分重要的；，所以必须在在DNA的质量和纯度上做出最佳的平衡选择，Krsek和Welington
错误！未找到引用源。
认为玻珠+溶菌酶+SDS的组合可从土壤中获较高产量和纯度的DNA。
错误！未找到引用源。
直接提取法参照Krsek和Welington 步骤方法如下：
实验试剂：
的试验方法并略作改变，具体使用试剂和
DNA提取液（1%(W/V) CTAB(十六烷基三乙基溴化铵) 1.5mol/lNaCl、100mM磷酸钠、100mM Tris-HCl、100mM EDTA、PH=8）；20mg/ml蛋白酶K；50mg/ml溶菌酶；10%SDS；饱和酚；酚/氯仿/异戊醇(25：24：1 V/+V)；氯仿；100%乙醇；70%乙醇；异丙醇。
提取步骤：
1.称取1g土样放入2.0 mL EP管中，然后加入1 mL提取缓冲液混匀，在细胞裂解过程中将所提取样品于液氮和65℃水浴中反复冻融2次；
2.加入溶菌酶(终浓度5mg/ml) 和蛋白酶K（终浓度0.2 mg/mL），并加入终浓度为1％的SDS混合均匀，在65 ℃水浴中放置60 min，期间每20 min颠倒混匀一次，12,000 rpm离心20 min，小心的将上清液转移到另一个干净的EP管中；
3.加入等体积酚/氯仿/异戊醇，上下颠倒EP管混匀，12,000rpm 离心10 分钟，将上清液转入另一洁净的EP管中；
4.在上清液中加入等体积的氯仿，上下颠倒EP管混匀，12,000 rpm离心10min，将上清液转入另一洁净的EP管中；
5.加入0.6倍体积预冷的异丙醇，上下颠倒EP管混匀，并在-20℃放置1小时，12,000 rpm室温离心15min；
6.小心的弃去上清，使用75%乙醇洗涤沉淀两次，在室温下自然干燥，用50μl灭菌双
蒸水或TE缓冲液重悬DNA 沉淀，充分溶解后放入－80 ℃冰箱保存。
试剂盒提取方法和步骤参照说明书进行，所提取DNA放入－80 ℃冰箱保存。
2.3 电泳检测
琼脂糖凝胶电泳是一种常规的DNA检测方法，根据凝胶浓度、电泳时间和电压大小的不同，可以有效分离0.1Kb-60Kb之间的DNA片段。
实验试剂：
琼脂糖；1×TAE 电泳缓冲液（TAE：0.04 M Tris-醋酸，0.001 M EDTA）；EB (Ethidium bromide，溴化乙锭)溶液或GeneFinderTM染料(Bio-V公司)等核酸染料。
实验步骤：
1. 称取0.8g-1.5g琼脂糖（视实验所需分离DNA片段大小而定）加入到三角瓶中，加入100ml 1×TAE 溶液，于微波炉中加热，稍待冷却后，倒入已插上样品梳的凝胶槽中；
2. 水平放置等待琼脂糖凝固，小心拔出梳子，将凝胶连同凝胶槽一同放入已校准水平的电泳槽中，电泳槽中加入1×TAE电泳液缓冲液，高于凝胶表面约0.5cm为适；
3. 将含有指示剂的DNA样品和DNA Maker分别加入点样孔后接通电源，设定电压和电泳时间（视实验所需分离DNA片段大小和凝胶大小而定）；
表2-1 凝胶浓度与DNA片段大小的关系
Table 2-1 The gel concentration used for various length of DNA fragment 琼脂糖凝胶浓度（%）
0.3 0.6 0.7 0.9 1.2 1.5
线性DNA分子的有效分离范围（kb）
5-60 1-20 0.8-10 0.5-7 0.4-6 0.2-3
4.一般电泳至指示剂离胶前沿1/3处时结束电泳（视DNA片段大小而定），关闭电源，将凝胶放入染色液中染色（如使用EB，操作时应带乳胶手套操作），在紫外成像仪上成像并拍照。
2.4 DNA的纯化
对于手工方法提取的土壤总DNA中含有较多杂质，直接进行PCR扩增效果较差，因此对DNA样品进行纯化处理，本试验纯化采用琼脂糖割胶回收或电洗脱法对DNA进行纯
化，电洗脱法适用于回收大于5Kb的片段效果较好。
电洗脱法纯化步骤：
1.透析袋的预处理：选取长为10～20 cm的透析袋，将透析袋在1mM EDTA（pH8.0）、2%（w/v）NaHCO3溶液中煮沸10分钟，取出透析袋用蒸馏水彻底冲洗，在1mM EDTA溶液中（pH8.0）煮沸10分钟，让透析袋自然冷却，4℃贮存（贮存期间，要始终让透析袋浸入溶液之中）；使用前，用蒸馏水充分冲洗袋的内外壁（操作时要带手套）；
2.将 DNA电泳分离后染色，确定目标片段的位置，使用手术刀片切下含有目的DNA片段的凝胶；将透析袋一端封紧，并将透析袋装满1×TAE，然后将所切胶条放入透析袋中，倒掉多余的缓冲液（只留100μL左右），夹紧另一端（袋内不能留有气泡）。
3.将含有胶的透折袋放在1×TAE电泳槽中，4-5 V/cm，2-3小时，DNA被电泳脱到袋子壁上；更换电极，反向电泳30s-1min（关键步骤），使DNA从袋壁返回袋腔；
4.打开透析袋，小心地倒出胶周围的电泳缓冲液于一灭菌EP管中，然后用少量1×TE冲洗袋壁，并将冲洗液一并吸入EP管中；将透析袋及胶条置于紫外灯下，观察收集是否完全，如有残留，可重复步骤3；
5.将收集溶液用苯酚/氯仿和氯仿各抽提一次，加入0.1体积3M醋酸钠，用2倍体积无水乙醇沉淀，70%的乙醇洗2-3次，干燥后溶于适量的灭菌双蒸水或TE缓冲液，所得DNA用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测其质量及片段大小并放入－80 ℃冰箱保存。
琼脂糖割胶回收具体步骤如下：
1. 在紫外灯下切下含有目的DNA片段的胶条、称出其质量（m），放入灭菌1.5 mL离心管中，按照m∶V(mg∶mL）=1∶1的比例加入相应体积的Binding Buffer；
2. 将混合好的溶液物置于55～65℃水浴10min溶解胶块，直至凝胶完全溶解，期间每2～3 min轻柔混匀一次，若混合液的颜色变为红色或橙色，需加入8.4 μL 3M pH5.2的NaAC调整pH值，使混合液颜色变为淡黄色；
3. 将混合液转移到套有2 mL收集管的吸附柱中（每次不超过700 μL），10000 rpm，2 min，弃去滤出液；
4. 以300 μL Binding Buffer润洗吸附柱，10000 rpm，2 min，弃去滤出液；
5. 向吸附柱中加入700 μL SPW Wash Buffer，室温下静置2 min，10000 rpm，2 min，弃去滤出液；重复操作一次；
6. 重新组装吸附柱和收集管，10000 rpm，1min（此步不可省略）；
7. 将上层吸附柱转移至一新的灭菌1.5ml离心管中，向吸附柱滤膜上加入30 μL的Elution Buffer，室温下静置5～10 min待DNA充分溶解，10000 rpm，2 min；
8. 再向吸附柱滤膜上加入20 μL的Elution Buffer，室温下静置5～10 min待DNA充分溶解，10000 rpm，2 min；将两次得到的约50 μL含有DNA的Elution Buffer存于－20℃备用。
2.5 PCR技术
2.5.1细菌16S rDNA V3区的扩增
分别以以实验所提取的12个总DNA样品为模板，16S rDNA V3可变区特异性引物
未找到引用源。
错误！
F357和R518-GC（表2-2）扩增土壤微生物16S rDNA V3可变区，其中，GC片段
错误！未找到引用源。
可以提高DGGE条带分离的灵敏度（表2-3）。
，引物由上海生工合成；PCR反应体系为25μL
表2-2 本研究所用PCR引物 Table 2-2 PCR primers in this study
PCR primer F357-GC F357 R518 357F-GC-M
13R 518-AT-M13
F M13-47 RV-M F27 1492r
Sequence(5’ - 3’)
CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG
CCTACGGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTGG
CAGGAAACAGCTATGACGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAG
GCAGCAG
GTAAAACGACGGCCAGTAAATAAAATAAAAATGTAAAAAAATTACCGCGGCTG
CTGG
CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
AGAGTTTGATCCTGGCTCA TACCTTGTTACGACTT
表2-3 16S rDNA V3区 PCR扩增反应体系组成
Table 2-3 Amplification reaction system of 16S rDNA PCR V3 组成成分 F357-GC R518 10×buffer dNTPs 模板DNA
EX Taq DNA 聚合酶
ddH2O
用量
0.5μL
0.5μL 2.5μL 2μL 1.0μL 0.2μL 18.5μL
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扩增程序采用降落PCR(touchdown-PCR，td-PCR)，使用该方法可以很好的
降低由于存在多种DNA模板时引物和模板之间错配产生的非特异性扩增，对于降落PCR，退火温度的选择对PCR特异性的影响极为重要，经过大量的准备试验对比发现，对于本试验样品，将退火起始温度设为65℃所得到的结果最佳；由于使用通用引物，因此，过多的循环会造成大量的人工产物，本实验通过准备试验对比发现，对于本试验样品25+5的循环数组合得出的实验结果最佳，表现为目标条带较细，引物二聚体不明显；通过大量预试验比较发现模板稀释100倍后，所扩增效果最好。最终得出本实验扩增程序如下：
95 ℃ 5 min
94 ℃ 45 s 65 ℃-55 ℃ 30 s 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10 min
}
25个循环(退火温度从65℃降到55℃，每两个循
环退火温度降低1℃，55℃5个循环
PCR扩增产物约为250bp,扩增结果使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
由于扩增模板采用的是土壤总DNA的呼和模板，因此，在扩增时会产生部分假阳性产物，如异源双链
错误！未找到引用源。
，这会大大影响下一步实验结果，如以降落PCR产物为模板再
错误！未找到引用源。
次进行Reconditioning PCR，可以明显消除PCR产物中存在的异源双链反应体系为50μL（表2-4）。
。PCR