表2-4 Reconditioning PCR增反应体系组成
Table 2-4 Amplification reaction system of Reconditioning PCR 组成成分 F357-GC R518 10×buffer dNTPs TD-PCR产物 EX Taq DNA 聚合酶
ddH2O
Reconditioning PCR扩增程序：
95 ℃ 5 min 94 ℃ 1 min 55 ℃ 1 min 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10 min
用量
1μL
1μL 5μL 4μL 5.0μL 0.3μL 34μL
}
5个循环
PCR扩增结果使用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.5.2细菌16S rDNA片段的扩增
将所有桉树人工林土壤样品中所提取的总DNA混合后为模板，采用细菌16S rDNA通用引物
错误！未找到引用源。
F27和R1492（表2-2）扩增土壤微生物16S rDNA，引物由上海生工合
成；PCR反应体系为50μL（表2-5）。
由于PCR扩增存在偏向性，为减小误差，在实验过程中采用平行扩增，即平行扩增3组，扩增后混合PCR产物。
表2-5 16S rDNA PCR扩增反应体系组成
Table 2-5 Amplification reaction system of 16S rDNA PCR 组成成分 F27 1492r 10×buffer dNTPs 模板DNA DNA 聚合酶 ddH2O 扩增程序如下：
用量
1μL
1μL 5μL 4μL 1.0μL 0.5μL 37.5μL
95 ℃ 5 min 94 ℃ 45 s 55 ℃ 30 s 72 ℃ 1 min 72 ℃ 10 min
}
30个循环
PCR扩增产物约为1.5Kb,扩增结果使用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
2.6 感受态细胞的制备
本实验所制作感受态细胞适用于化学转化法，具体制作方法步骤如下：
1. 从—80℃冰箱取出实验室所保存的E.coli菌体进行活化，活化后在LB平板上划线过夜培养；
2.从单菌落中挑取一环E.coli菌体，接种于5 mL LB，37 ℃摇床过夜培养，对制作感受态细胞所要使用的移液器、枪头和离心管进行再次灭菌，灭菌前最好将要使用的枪头后端塞入小块棉花，避免移液器中细菌吹入污染培养基；
3.从5 mL LB中取1 mL过夜培养的培养液加入100 mL LB的三角瓶中，37 ℃摇床培养至OD600约为0.4（约2小时）时，取出培养基冰上放置10分钟冷却；
4.将冷却的菌液转入250 mL离心管，4℃ 4000 rpm离心10分钟，弃上清，加入10 mL预冷的0.1M CaCl2中，小心用枪头吹打将菌块重新悬浮，冰浴25分钟后4℃4000 rpm离心10分钟，弃去上清液；
5.再次将菌块重悬浮于10 mL预冷的CaCl2溶液中，冰浴25分钟后4℃4000 rpm离心10分钟，弃去上清液；
6.加入1 mL预冷的0.1M CaCl2中，并加入灭菌的60%的甘油至终浓度10%，小心用枪头吹打将菌块重新悬浮，并分装于1.5mlEP管中，每管50 μL，验证后放入-80℃冰箱保存备用（如将分装好的感受态细胞在4℃下放置12~24小时可提高转化效率）。
注意：感受态细胞制作过程当中所有操作须在冰上进行且严格要求无菌操作。
2.7 DNA的连接和转化
2.7.1 DNA的连接
本实验DNA的连接使用TaKaRa公司pMD18-T载体试剂盒，具体操作步骤按照说明书上方法进行，在1.5ml EP管中加入所需载体和外源（2-6），轻轻混匀后，放16℃水浴过
夜，最短连接时间为30min，但延长连接时间将提高连接效果。
表2-6 DNA连接反应体系组成 Table 2-6 Reaction system of DNA link 组成成分 载体DNA 外源DNA Ligation Mix ddH2O
用量
~20 ng
~60 ng 5 μL L to 10 μL
2.7.2质粒DNA的转化
本实验采用化学转化法进行质粒DNA的转化，具体操作步骤如下： 1. 将以制备好的的化学法感受态细胞从-80℃冰箱取出，置于冰上融化；
2. 待感受态细胞融化后，加入需要转化的质粒DNA 5 μL，轻轻混匀后冰浴30min； 3. 将混合感受态细胞和质粒的EP管放入42℃水浴锅水浴热激90秒；
4.在冰上放置1-2分钟后，加入200μL的LB培养基，37 ℃摇床(125 rpm)振荡培养45~60 min；
5. 取50-150 μL涂布在含相应抗生素的筛选平板上（表2-7），置于37 ℃培养箱培养过夜。
表2-7 蓝白筛选平板配方
Table 2-7 Bule and white screen formula 组成成分 LB培养基 AMP X-gal IPTG
用量
200ml 400μL（50mg/ml） 160μL（50mg/ml） 80μL（100mg/ml）
2.8DGGE技术
2.8.1 样品制备
实验样品为2.5.1所扩增PCR产物，根据样品浓度进行真空干燥浓缩后使用。
2.8.2 DGGE所用仪器和相关试剂
实验仪器：
BIO-RAD公司基因突变电泳检测仪（BIO-RAD DCodeTM Universal Mutation Detection System）；
实验试剂：
1.50×TAE电泳缓冲液（2mol/LTris 乙酸盐，0.05mol/L EDTA pH8.0）1L体积：242gTris，57.1mL 冰醋酸，100mL 0.5mol/L EDTA pH8.0，加水至lL。）；
2. 40%丙烯酞胺凝胶贮藏液(Acrylamide/Bis=37.5∶l)；去离子甲酰胺（formamide （deionized））；尿素（Urea）；N，N，N’，N’－四甲基二乙胺(TEMED)；
3.10% 过硫酸铵（APS）10mL 配制：1g 过硫酸铵加水至10mL；
2.8.3 DGGE凝胶的制备
本试验制备为平行胶，这种胶从上至下变性剂的浓度递增，适用于分析大量样品，DGGE凝胶制备步骤如下
错误！未找到引用源。
：
1.首先根据要分离片段大小确定凝胶浓度和变性剂浓度（表2-8），并根据要灌制凝胶的长宽及厚度确定要配置的丙烯酰胺体积，本试验胶板采用16×16 cm，厚度1 mm，配置凝胶浓度8％的低浓度溶液（30%）和高浓度溶液（60%）各15ml（表2-9）；（注意，由于丙烯酰胺有剧毒，因此以下实验操作必须小心进行，并佩带手套口罩做好自我保护措施）
表2-8 凝胶浓度与相对应的最佳分离片断长度
Table 2-8 Gel concentration and the corresponding length of separating fragments
凝胶浓度
6% 8% 10%
片段长度
300～1000 200～400 100～300
表2-9 8%浓度的变性胶的配方（100ml） Table 2-9 8％Gel Denaturing Solution (100 ml)
Reagents
40?rylamide/Bis (37.5:1)
50x TAE buffer formamide (deionized)
Urea ddH2O
TEMED（实验中再加入） 10%APS（实验中再加入）
30% Denaturing Solution
3 mL 0.5 mL 1.8 mL 1.89 g 9 mL 10μL 200μL
2.组装平行胶玻璃板。将两块洗好晾干的的玻璃板按照正确的方法组装，注意玻璃板下部和压条必须平行，加紧玻璃时必须平衡用力，否则会出现漏胶或凝胶破裂等现象而导致制胶失败；
60% Denaturing Solution
3 mL
0.5 mL 3.6 mL 3.78 g 6 mL 10μL 200μL
3.给注射器做好标记，一个为低浓度溶液，一个为高浓度溶液防止实验时拿混，清洗两个注射器和含有“Y”形接口的胶管、针头，确保其中没有凝胶堵塞，清洗后将水排干，把针头用夹子固定在玻璃板顶端并用软管和“Y”形接口相连；
4.设置灌胶器，本实验使用灌胶器为伯乐公司原装配套产品，采用齿轮控制，手动灌胶，由于梯度浓度的形成与灌胶速度无关，因此该系统形成的梯度浓度非常准确，并可重复进行，并可以通过滑动杆调节传送不同体积的溶液，本实验设定为14.5，注意，设置值应低于实际凝胶溶液体积；
完成以上四部后，应熟悉以下实验步骤，操作时必须严格控制在10分钟之内完成，否则可能会出现凝胶凝结而无法灌胶。
5.给低浓度溶液和高浓度溶液中分别加入TEMED和10%APS，注意，每加完一种溶液后应充分混匀再加入另一溶液，加完后混匀，分别吸入标有标记的注射器中，排净注射器中气泡，并将胶溶液推到胶管末端；
6.将装有低浓度溶液的注射器固定在灌胶系统注射器固定器上（低浓度一侧），拧紧螺帽固定好注射器，把注射器末端的附加螺杆插入到灌胶系统的小槽中，用同样方法固定高浓度溶液的注射器；
7．将胶管和“Y”形接口连接，开始灌胶，灌胶时要匀速缓慢的转动齿轮，灌胶结束后插入梳子并迅速用水清洗注射器、胶管和针头，防止堵塞影响下次使用；
8.凝胶室温放置60min后，小心拔取梳子；
9.在凝胶过程当中可以打开电泳仪电源、回流泵及控温装置，对电泳缓冲液进行预加热，需要注意的是在加热过程中每当要从电泳槽中拿出控温装置时都需要关闭电源2分钟预冷后才能取出。
2.8.4 电泳
1.将治好的玻璃凝胶夹板用电泳夹具夹好，放入电泳槽中，在两个两个玻璃凝胶夹板中加入1×TAE，检查加样孔内是否有残留的凝胶碎片或气泡，可用移液器或小针头冲洗或挑出；
2. 打开电泳仪电源、回流泵及控温装置开关，对电泳缓冲液进行加热，本试验设定温度为60℃，等待温度加入到预定温度时可移去温控装置，关闭电源后迅速在加样孔中加入已和2×Gel Loading Dye混合的PCR产物，一般每个加样孔控制在20μL以下，防止样品溢出流入其他加样孔；