3.点样完毕后将控温装置放回原处，打开电泳仪电源、回流泵及控温装置开关，待电泳缓冲液温度重新升高至设置温度后，设置电泳电压和时间，开始电泳，本实验温度60℃，电压180伏特，时间4.5小时。
4.电泳完毕后关闭电源，待加热器冷却后，再小心的取出凝胶玻璃板，从玻璃板上将凝胶剥离下来，由于凝胶很薄，因此在操作中必须格外小心，防止凝胶破碎。
2.8.5 染色
本试验染色采用银染法和GeneFinderTM染料染色法。 实验试剂：
10%醋酸、1%硝酸、硝酸银（AgNO3）、无水碳酸钠（Na2CO3）、甲醛、硫代硫酸钠 银染法实验步骤错误！未找到引用源。：
1.固定：将从玻璃板上剥离下来凝胶的凝胶放入500ml10%醋酸溶液中固定15 min -30 min，固定过程中可进行缓慢摇动；
2.氧化：将固定好的凝胶用去离子水洗涤2次，每次1min，之后放入500ml1%硝酸溶液中氧化5 min；
3.染色：将凝胶氧化后用去离子水洗涤1次，1min，之后放入500ml染色液（0.5g AgNO3、0.5mL37%甲醛）中，染色30min，固定过程中缓慢摇动染色液；
4.显影：用去离子水将凝胶冲洗后，立即转入500ml显影液中（2.5mg 硫代硫酸钠、0.5mL37%甲醛）进行显色，显色过程当中必须缓慢摇动显色液，使显色更为均匀；
5.终止反应：但在显影液中可以看到条带时，立刻取出凝胶放入10%醋酸溶液中5 min终止反应；
6.洗涤：将以成像凝胶在去离子水清洗后照相，或做成干胶保存。 GeneFinderTM染料染色步骤：
将从玻璃板上剥离下来凝胶的凝胶放入GeneFinder染液中浸泡，30min后取出即可。
2.8.6 DGGE图谱分析
目前对于电泳图谱分析有很多软件，如：BandScan、Gel-Pro analyzer、Quantity One和BandLeader等。本实验DGGE图谱均采用由用Bio-Rad公司的凝胶定量软件Quantity One，版本号为4.6.2，该软件是一款功能很强大、通用性很强的电泳图像定量分析软件，除了支持Bio-Rad 公司的凝胶分析仪获得的数据外，Quantity One 还可以分析8位和16位灰度的TIF 文件；Quantity One 能够直接对黑色背景、白色条带的图谱进行分析，如图谱不是该类
型，则需要转化成黑色背景、白色条带的图谱；分析过程主要采用轨迹定量法，这种方法的最大优点在于它可以完全抛弃人为的主观因素进行全自动定量。该软件简单易学，在对图谱分析时，首先使用基本的背景排除功能，对图谱进行优化处理，然后经过泳道(Lane)识别、条带(Band)识别和配对(Match)三个步骤，对图谱中的条带进行定量分析，为了减少样品浓度所造成的影响每条条带的灰度值用平均灰度区分
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。
根据定量结果，还可以使用其自带数据包进一步分析得到泳道的对比分析结果，如：泳道对比图(Compare Lane Images)和相似性矩阵图(Similarity Matrix)，并且可以通过UPGMA(Unweighted Pair-Group Method Using Arithmetic Average)软件包对每个泳道的条带所代表的微生物群落进行相似性聚类分析。另外，该软件还可以直接将泳道和条带的分析结果以二进位格式输出，应用于多元统计分析方法。
2.8.7 DGGE主要条带的回收
用于回收主要条带的聚丙烯酰凝胶只能采用核酸染料GeneFinderTM(Bio-V公司)进行染色，而不能使用银染法染色。
根据图谱，确定要回收的优势条带，在紫外灯下用无菌手术刀切下含有目的片段的胶块，对于每个条带，尽量只选择其中间部分进行切割，将回收的条带装入一干净的1.5 mL EP管中，并用枪头挤碎，加20 μL灭菌双蒸水，放置4 ℃冰箱过夜；取1 μL上清液为模板，选用F357和R518为引物（表2-1）引物进行PCR扩增目的DNA片段，反应体系50μL，按照2.5.2中PCR程序进行扩增。
扩增产物使用胶回收试剂盒纯化，具体步骤参照说明书，将纯化产物与PMD18-T（TaKaRa）载体连接（具体步骤见2.6），采用化学转化法转化E.coli DH5α感受态细胞（具体步骤见2.6），通过蓝白斑筛选出阳性克隆子（具体步骤见2.6），直接以阳性克隆子上为模板，载体特异性引物M13-47和RV-M为引物，采用菌体PCR的方法法扩增出外源片段验证克隆是否为假阳性；再以F357-GC和R518为引物扩增目的条带使用DGGE进行验证，验证结果无误后将阳性克隆子穿刺培养接种到含Amp培养基的1.5mlEP管中，37℃培养过夜，最终送上海生工进行测序。