省科技攻关计划项目可行性研究报告(4)

本项目属科技攻关项目，主要是完成技术性研究，取得该技术领域的科研成果。产业化达产后，预计可实现产值10亿元人民币，年销售收入6亿元人民币，年利税3亿元人民币，年创汇1000万美元。用腺病毒携带IL-24基因治疗肿瘤的方法可形成专利。
六、研究方案、技术路线、组织方式与课题分解
1、重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的技术方案
1.1 重组人白细胞介素-24腺病毒的建立
（1） 人白介素-24基因的克隆
从人外周血单个核细胞中提取mRNA，设计并合成特异引物，应用PCR的方法扩增得到人白细胞介素-24的基因片段。
（2） 人白介素－24基因序列的确证
将用PCR扩增出的人白介素-24基因，进行测序，并与GeneBank报道的结果比较，以确定扩增的白介素－24基因序列的正确性。
（3 ）携带人白细胞介素－24基因腺病毒穿梭质粒载体的构建与鉴定
采用基因工程的方法，将人白细胞介素－24基因克隆至腺病毒穿梭质粒载体中，通过限制性内切酶图谱法鉴定人白细胞介素－24基因是否重组到腺病毒穿梭质粒载体中。
（4） 重组人白细胞介素－24腺病毒的构建
通过脂质体转染技术，将携带人白细胞介素－24基因腺病毒穿梭质粒载体转染293细胞（人胚肾细胞），提取重组腺病毒DNA进行PCR鉴定。
（5） 扩增前重组人白细胞介素－24腺病毒的空斑筛选
利用噬斑纯化方法，将感染重组腺病毒的293细胞进行培养，挑选出单个重组腺病毒，以保证扩增的纯度和稳定性。
（6） 重组人白细胞介素－24腺病毒的扩增、纯化
将经噬斑纯化获得重组腺病毒大量感染293细胞，以大量生产重组腺病毒。待感染病毒的293细胞成熟后收获细胞，经反复冻融及离心等方法，除去细胞碎片，收集上清，获得重组腺病毒。并通过超滤和离子交换的方法来纯化和浓缩重组腺病毒，从而获得大量、高滴度、高纯度的重组人白细胞介素-24腺病毒样品。
1.2、 重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法的建立
参照国家«人基因治疗研究和制剂质量控制技术指导原则»、«中国生物制品规程»、«中国药典»（2000年版）等要求建立重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的质量控制和检测方法。着重对重组人白细胞介素-24腺病毒制品的病毒的纯度、病毒滴度的测定和复制型病毒（RCA）、腺相关病毒检测的方法学研究。
（1）比活性：病毒比滴度=病毒感染滴度/病毒颗粒数测定
（2） 复制型病毒（RCA）的检测：A549细胞检测法，每3.0×1010VP中应不高于1RCA（即≤1RCA/3.0×1010VP）
（3）腺相关病毒的检测
采用PCR法，应无腺相关病毒（AAV）的污染。
（4） 病毒纯度检测
采用高效液相色谱法或A260/A280法  纯度大于95%。
1.3 重组人白细胞介素-24腺病毒注射液的抗肿瘤实验
将重组人白细胞介素-24腺病毒注射到肿瘤细胞，观察重组人白细胞介素-24腺病毒抗肿瘤效果。
2、本企业在生产场地、公用工程、辅助设施等方面已具备的条件和需新增加的基本建设内容。
我单位有研究开发基因药物的专业性生物技术研究所，有着从事多年生物技术药物研究和开发经验，曾研制出“注射用重组人白介素-2（125Ser）、注射用重组人白介素-18、α-2b干扰素口含片、新型溶栓酶”等高科技生物药品，具有良好的科研基础。配备有较完善的科研生产检测仪器和设备：DNA合成仪、PCR扩增仪、70L贝克曼的发酵罐、发玛西亚的蛋白层析系统、Waters的高效液相、万级净化级别的实验室等。现有生物药品GMP生产车间和两条生物药品生产线，具备良好的生产条件。
3、述生产过程中“三废”排放、“三废”处理的措施和生产过程中职业危害因素分析及采取的保护措施方案。
重组人白细胞介素-24腺病毒注射液研制和生产过程，无三废排放。
4、特殊行业许可证报批情况
我单位企业法人营业执照（执照号：3700001806768）、药品生产企业许可证（证号：鲁01Sz20010020）和药品GMP证书（证书编号：C1064）等证照齐全。