分别吸取猪去氧胆酸对照品溶液、供试品溶液与阴性溶液,按上述色谱条件进行检测,结果供试品、猪去氧胆酸对照品在相应时间出现猪去氧胆酸特征吸收峰,阴性溶液无干扰吸收峰。结果见图1。
2.4 标准曲线及线性范围
分别精密吸取猪去氧胆酸对照品溶液1、2、3、4、5 mL,加60%乙腈稀释至10 mL,在上述色谱条件下,进样10 μL,测定峰面积值。以峰面积平均值和对照品溶液浓度进行回归处理,回归方程为：A＝5.755 10×105C－2.114 200×103,r＝0.999 6；猪去氧胆酸在0.201 35～1.006 75 mg/mL浓度范围内与峰面积呈良好线性关系。
2.5 最低检测限
取0.201 35 mg/mL的对照品溶液用60%乙腈稀释1倍,得0.101 675 mg/mL的溶液,取10 μL进样测定,S/N＝3,故最低检测限为1 μg。
2.6 精密度试验
取浓度为0.604 05 mg/mL对照品溶液10 μL进样测定,连续6次,结果RSD＝1.6%。
2.7 重复性试验
取清开灵注射液样品,按照“2.2.2”项下方法制备供试液,平行试验6份,测定猪去氧胆酸的含量,结果RSD＝2.4%。
2.8 稳定性试验
取供试品溶液,每隔2.0 h进样10 μL,测定猪去氧胆酸12 h内的峰面积值,结果RSD＝2.8%。
2.9 加样回收率试验
精密称取猪去氧胆酸对照品,配制成浓度为2.013 5 mg/mL对照品溶液。另取清开灵注射液(批号060102)5 mL,平行试验9份,分别加入对照品溶液,按上述色谱条件测定,结果见表1。 表1 加样回收率试验结果(略)
2.10 样品含量测定
取本品3批(批号分别为060101、060102、060103),按供试品溶液制备方法制备供试液,测定猪去氧胆酸的含量,结果见表2。表2 3批样品中猪去氧胆酸的含量测定结果(略)
3 讨论
醋酸乙酯振摇提取次数对猪去氧胆酸提取有一定影响,经试验考察,振摇提取3次可提取98%,提取4次可提取完全,结果与《中华人民共和国药典》中胆酸的提取相一致。
经试验,在上述色谱条件下,胆酸与猪去氧胆酸的分离度为3.7,可完全分离,因此,可同时测定这两个成分,更利于清开灵注射液的质量控制。本试验胆酸、猪去氧胆酸的含量测定方法均与药典中胆酸含量测定方法一致,考虑到胆酸含量测定方法已经比较成熟,因此,未做胆酸含量测定的方法学考察。
因胆酸和猪去氧胆酸的检测波长为192 nm,为末端吸收,基线噪音较大。清开灵注射液中胆酸、猪去氧胆酸的含量较高,受到的影响较小,含量测定较准确。如为含量较低的药品,所受影响较大,可考虑采用高效液相色谱-蒸发光散射法测定,已有文献报道,该方法猪去氧胆酸的最低检测限为5 ng[3]。对此,我们将做进一步研究。
【参考文献】
[1] 北京中医学院.北京中医学院三十年论文选[M].北京：中医古籍出版社, 1986.471－478.
[2] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.610.
[3] 曹 进,徐 燕,王义明,等.清开灵注射液中三种胆酸含量测定方法比较[J].中成药,2003,25(9)：705－708.