作者：黄欣 朱碧云 吕带弟 陈伟立 黄晓琳 李浩明
【摘要】 目的 克隆红曲霉和土曲霉洛伐他汀合成酶调控基因lovE和mkH，并进行序列分析和同源性比较。方法 根据GeneBank土曲霉和红曲霉洛伐他汀合成酶基因序列设计引物，以土曲霉和红曲霉基因组DNA为模板PCR扩增lovE和mkH基因并克隆到pMD19T simple载体。利用DNAMAN等软件以及互联网资源对lovE和mkH测序结果与其编码的氨基酸序列进行分析比对。结果 分别扩增得到1 512 bp和1 464 bp的目的片段lovE和mkH。结论 lovE和mkH同源性很高，并与GeneBank中相关已知序列基本相同，是洛伐他汀生物合成酶调控基因，且其表达产物为GAL4类转录因子。
【关键词】 土曲霉 红曲霉 洛伐他汀 转录因子 调控基因
洛伐他汀是胆固醇生物合成中的关键酶HMG?CoA还原酶的竞争性抑制剂，是目前治疗高血脂症最有效的药物之一［1-3］，它可下调炎症相关转录因子的表达，减缓动脉粥样硬化［4,5］，并可促进恶性甲状腺细胞凋亡［6,7］，具有抑制乳腺癌细胞增殖的功能［8］。
土曲霉洛伐他汀合成酶基因簇包括lovA?lovG以及lovI和lvrA等基因［9-11］。红曲霉洛伐他汀合成酶基因簇包括mkA?mkI等9个基因。其中lovE和mkH分别是土曲霉和红曲霉洛伐他汀生物合成的调控基因，编码GAL4类转录因子，其氨基酸序列中半胱氨酸富集的DNA结合区域表明含有Zn2Cys6型锌指结构域［12-14］。为深入研究洛伐他汀生物合成调控基因的生物学功能并利用这类转录因子来调控洛伐他汀合成代谢，本研究首次从国内常用工业原始出发菌株土曲霉CCTCC AF93208和红曲霉CICC5031基因组中PCR扩增克隆洛伐他汀合成酶调控基因，并对该基因和其编码的蛋白产物进行序列分析对比。
1 实验材料
1.1 菌株和培养基
土曲霉（Aspergillus terrus）CCTCC AF93208：中国典型培养物保藏中心;红曲霉（Monascus anka）CICC 5031：中国工业微生物菌种保藏中心;大肠杆菌DH5α为本实验室保藏;大肠杆菌LB培养基和LB/Amp培养基均按实验室常用培养基的配置方法配置。
斜面培养基［15］（g/L）：察氏培养基（蔗糖 30 g，NaNO3 3 g，K2HPO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0. 5 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，琼脂 15 g，纯净水 1 000 mL）。
菌丝生长培养基［15］（g/L）：葡萄糖 50 g，酵母膏 10 g，番茄酱 20 g，CaCO3 1 g，pH 7.2～7.5。
1.2 试剂
PCR引物由英俊生物技术有限公司合成。Taq酶采用fermentas的Taq recombinant。OMEGA的胶回收试剂盒D2501?01。Takara公司的pMD?19T simple克隆载体。Takara公司的DNA Marker DL2000和100 bp ladder。其他常规化学试剂均为国产分析纯。
2 实验方法
2.1 培养方法
用2 mL无菌水冲洗孢子，接入固体斜面培养。固体斜面培养7 d后，以5 mL水洗下，稀释至浓度为107个/mL，取2 mL加入100 mL菌丝生长培养基，转速150 r/min，28℃培养4 d。
2.2 基因组DNA提取
过滤取菌丝球（尽量吸干），称重并转入-20℃预冷的研钵。每克菌丝球加入3 g石英砂，0.4 mL提取液［100 mmol/L Tris?HCl(pH8.0),20 mmol/L Na2EDTA,0.5 mol/L NaCl,1% SDS］，0.5 mL有机液（酚/氯仿/异戊醇 （体积比）25∶24∶1）。将上述混合物于预冷研钵中剧烈研磨1 min直到成黏稠状细粉。每克菌丝球再加入4 mL提取液，2 mL有机液，充分混匀。用已剪枪头吸转至1.5 mL EP管，室温16 000 g离心5 min。吸转水相到新管，加0.6倍体积异丙醇，室温静置10 min，4 ℃16 000 g离心15 min，弃废液。95%乙醇润洗沉淀，稍微风干。加340 μL重溶液1［10 mmol/L Tris?HCl(pH8.0),1 mmol/L Na2EDTA,20 μg/mL RNaseA］，37℃水浴30 min。按前比例有机液再抽提一次，300 μL水相转新管。加入0.5倍体积7.5 mol/L乙酸铵溶液和2. 5倍体积95%乙醇均匀混合，-20℃静置30 min，4℃16 000 g离心15 min，弃废液。95%乙醇润洗沉淀，风干。每管加入100 μL重溶液2［10 mmol/L Tris?HCl(pH8.0),1 mmol/L Na2EDTA］，-20 ℃保存［16］。