扇贝多肽经SmacXIAP通路抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡的作用(2)

　　1.1.2  仪器  紫外线辐照仪（北京师范大学光电仪器厂制造）， Leica DBI 4000 B荧光显微镜(Leica公司)，PCR仪（美国CLP公司）， PROTEAN Ⅱ型垂直电泳仪（美国BIO?RAD公司生产），DYY?Ⅲ8 型电泳仪（北京六一仪器厂）。
　　1.2  方法
　　1.2.1  细胞培养与实验分组  HaCaT细胞（韩国延世大学丁擘晓博士惠赠）加入完全培养基，置于37 ℃，体积分数0.50 CO2中常规培养。实验分为6 组：正常对照组（A组）、UVB模型组（B组）、UVB+1.42 mmol/L PCF组（C组）、UVB+2.84 mmol/L PCF组（D组）、UVB+5.68 mmol/L PCF组（E组）和UVB+5.68 mmol/L维生素C阳性对照组（F组）。将细胞种入置有盖玻片的6孔培养板内培养，细胞融合至50%～80%时，按实验分组进行处理。C、D、E组细胞在含有不同剂量PCF的培养液中预孵育2 h后, UVB照射（剂量20 mJ/cm2）；F组细胞在Vit C浓度为5.68 mmol/L的培养液中预孵育2 h后，UVB照射（剂量20 mJ/cm2），照射结束后继续常规培养。
　　1.2.2  Hoechst 33258染色检测细胞凋亡  各组细胞UVB照射结束后继续培养18 h, 吸尽各孔培养液，按照Hoechst 33258染色试剂盒说明进行操作，荧光显微镜下观察结果。同一处理组随机选择6个观察视野，每个视野观察200个细胞，计数凋亡细胞数，重复3次，计算细胞凋亡率。
　　1.2.3  琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡  将细胞按实验分组处理后, 继续培养18 h。然后收集细胞，按照DNA Ladder抽提试剂盒说明进行操作。将获得的DNA应用20 g/L 琼脂糖凝胶电泳。
　　1.2.4  蛋白印迹法（Western blot）检测胞浆Smac水平  将按实验分组处理后的细胞继续培养8 h[5],按文献[6]的方法提取胞浆蛋白，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。100 g/L SDS?PAGE电泳，每孔上样约25 μg蛋白质，电转移至硝酸纤维膜上，室温封闭2 h后加入Smac鼠多克隆一抗，4 ℃孵育过夜。TBST洗涤3次后, 加入1∶400稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗，37 ℃孵育40 min；TBST洗膜3次后DAB显色液显色，实验重复3次。胞浆内蛋白质水平以蛋白质与β?actin吸光度比值表示，应用凝胶分析软件Quantity one进行定量分析。
　　1.2.5  RT?PCR检测细胞内XIAP mRNA的表达
　　按实验分组进行处理后，继续培养12 h, 提取总RNA。按ExscriptTM RT reagent kit 说明逆转录为cDNA备用。XIAP cDNA 引物序列分别为：上游为5′?ATATACCCGAGGAACCCTGCC?3′，下游为5′?TTCCGGCCCAAAACAAAGA?3′，扩增片段长度为245 bp；内参GAPDH的引物序列分别为：上游为5′?CGTGGAAGGACTCATGACCA?3′，下游为5′?TCCAGGGGTCTTACTCCTTG?3′，扩增片段长度为509 bp。按照PCR Amplification kit说明进行反应。扩增条件为：95 ℃预变性3 min；94 ℃ 40 s、60 ℃ 40 s、72 ℃ 40 s，循环35次；最后72 ℃延伸3 min。10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物，实验重复3次。采用凝胶分析软件Quantity one进行半定量分析，XIAP mRNA的表达水平以XIAP与GAPDH比值表示。
　　1.3  统计学分析
    
　　用SPSS 12.0软件进行数据处理，数据间比较采用单因素方差分析。
　　2  结果
　　2.1  PCF抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡作用
    
　　琼脂糖凝胶电泳结果显示，B组有明显的DNA梯形条带，且梯形带灰度较高，A、F组及加入PCF各组（C、D、E组）均未见明显的梯形条带（图1）。
　　图1  DNA Ladder琼脂糖凝胶电泳图（略）
    
　　M：2 000 bp DNA Marker；A：正常对照组，未见梯形条带;B：UVB模型组，可见明显的梯形条带；C：UVB+1.42 mmol/L PCF组，未见明显的梯形条带;D：UVB+2.84 mmol/L PCF组，未见明显的梯形条带；E：UVB+5.68 mmol/L PCF组，未见明显的梯形条带；F：UVB+ 5.68 mmol/L Vit C阳性对照组，未见梯形条带