扇贝多肽经SmacXIAP通路抑制UVB诱导HaCaT细胞凋亡的作用(3)

　　显微镜下，A组细胞核形态规则，表面光滑，发出均匀的微弱的蓝色荧光；B组细胞核致密浓染，呈现核浓缩、边缘化或碎裂，发出亮蓝色荧光。F组及C、D、E组细胞核致密浓染，核浓缩、边缘化或碎裂的细胞数量明显减少。B组与A组比较，细胞凋亡率明显增加（F=165.096,q=36.535,P<0.01)，预先加入药物各组（C、D、E、F组）与B组比较，细胞凋亡率减少，差异有显著性（q=11.369～28.592,P<0.01)；随着PCF浓度的增加，细胞凋亡率减少，差异有显著性（q=7.259～9.965,P<0.01)。见表1。
　　2.2  PCF对UVB辐射的HaCaT细胞线粒体Smac释放的影响
    
　　SDS?PAGE凝胶电泳结果显示，B组与A组相比较，胞浆Smac含量明显增加（F=174.311,q=33.106,P<0.01)，预先加入药物各组（C、D、E组）与B组相比，胞浆Smac含量明显降低，差异有显著性（q=9.191～26.180,P<0.01)；且随着PCF浓度的增加，胞浆Smac含量明显降低，差异有显著性（q=6.926～10.063，P<0.01)。见表1。
　　2.3  PCF对UVB辐射的HaCaT细胞内XIAP表达的影响
    
　　B组与A组相比较，XIAP mRNA的表达显著降低（F=97.141,q=26.147,P<0.01)，预先加入PCF各组（C、D、E组）与B组相比，差异有显著意义（q=8.073～17.618,P<0.01)，且随着PCF浓度的增加，XIAP mRNA的表达显著降低，差异有显著性（q=3.706～5.839,P<0.05)。见表1、图2。
　　表1  各组HaCaT细胞凋亡指标的比较（略）
　　与A组比较，F=97.141～174.311，*q=26.147、33.106,P<0.01;与B组比较,#q=8.073～28.592,P<0.01；与C组比较,△q=5.839～9.965,P<0.01;与D组比较,※q=3.706～10.063,P<0.05
　　图2  XIAP mRNA基因表达琼脂糖凝胶电泳图（略）
    
　　A：正常对照组；B：UVB模型组；C：UVB+1.42 mmol/L PCF组;D：UVB+2.84 mmol/L PCF组；E：UVB+5.68 mmol/L PCF组
　　3  讨论
    
　　许多研究已证明，紫外线可诱导体内及体外培养的人类正常角质形成细胞发生凋亡。角质形成细胞是表皮的主要构成细胞。本文研究对象HaCaT细胞为永生化人类角质形成细胞。有研究表明，HaCaT细胞经UVB（500 J/m2）或UVC(100 J/m2)照射后，线粒体膜间隙蛋白细胞色素C和Smac释出，激活caspases级联反应，细胞发生凋亡[7]。由于线粒体在控制细胞凋亡中起主导作用，已成为目前细胞凋亡研究的热点。本实验通过复制UVB辐射HaCaT细胞的损伤凋亡模型，从线粒体内源途径探讨了PCF的保护作用及相关机制。

　　细胞凋亡的测定有多种检测方法，本实验采用了Hoechst 33258染色与寡核苷酸片段分析相结合的方法。Hoechst 33258染料能特异性结合细胞内的DNA，使细胞核发出淡蓝色荧光。染色后，在荧光显微镜下观察，正常细胞的细胞核呈正常的蓝色，而凋亡细胞的细胞核呈致密浓染或碎块致密浓染。根据细胞凋亡时DNA断裂形成不同倍数的180～200 bp核酸片段，在琼脂糖凝胶电泳上可呈现阶梯状条带(DNA ladder)特征。我们又进一步观察了PCF对UVB诱导HaCaT细胞凋亡的影响，结果显示，1.42 ～5.68 mmol/L剂量范围内的PCF可明显降低UVB诱导的HaCaT细胞的凋亡率。琼脂糖凝胶电泳结果显示，UVB辐射HaCaT细胞可诱导明显的DNA ladder 形成，不同浓度的PCF预处理细胞均可有效抑制UVB引起的DNA ladder 的形成。
    
　　Smac是2000年由DU等[8]与ANNE等[9]几乎同时发现的一种促凋亡分子,是caspases的激活剂。JIA等[10]将未剪接的成熟Smac转染到白血病细胞K562和CEM，检测显示白血病细胞对UV和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL)所致凋亡的敏感性升高，caspase?3和caspase?9的活性亦明显升高。本研究显示，与正常对照组相比，模型组HaCaT细胞胞浆内Smac表达明显增高。