EBV LMP2A逆转录病毒表达载体的构建及产毒细胞系的建立(2)

    1.2  细胞
    逆转录病毒包装细胞PT67购自中国武汉典型培养物保藏中心，用含体积分数0.10的胎牛血清、100 kU/L的青霉素、100 g/L链霉素的DMEM，于37 ℃体积分数0.05的CO2培养箱中培养。
    1.3  逆转录病毒的制备
    1.3.1  引物设计和目的基因的制备  根据GenBank提供的LMP2A基因编码序列，DNAstar软件设计扩增EBV LMP2A读码框架的特异性引物，并在上游引物和下游引物的5′端分别引入BglⅡ和EcoRⅠ酶切位点和保护碱基。其上游引物序列为：5′?GGCAGATCTATGGGGTCCCTAGAAATGG?TG?3′,下游引物序列为： 5′?CGGAATTCTTATACAGTGTTGCGATATGG?3′，扩增产物的长度为1 500 bp。用TRIzol法提取EBV阳性LCL细胞总RNA，按照逆转录试剂盒要求的标准条件合成cDNA用作PCR模板,扩增产物于12 g/L琼脂糖凝胶中电泳，紫外线透射仪下观察结果。
    1.3.2  逆转录病毒表达载体pMSCVpuro?2A的构建  用BglⅡ和EcoRⅠ双酶切LMP2A的PCR产物和质粒pMSCVpuro，纯化后连接形成重组质粒pMSCVpuro?2A，导入工程菌Ecoli.JM109中扩增，提取重组质粒。通过PCR、限制性酶切和测序分析进行鉴定。同时，以不含目的基因LMP2A的质粒pMSCVpuro作为载体对照。
    1.3.3  重组逆转录病毒的包装及阳性克隆的筛选
    常规培养包装细胞PT67达70％～80％汇合时，采用脂质体法转染重组质粒pMSCVpuro?2A，具体操作参照lipofectamine 2000说明进行。转染48 h后以1∶10传代，待细胞贴壁后加嘌呤霉素至终质量浓度10 mg/L进行筛选。约10 d后可见阳性克隆出现，分别选取细胞克隆扩大培养，获得产毒细胞系PT67?LMP2A。收集细胞培养上清，用0.45 nm的滤器过滤后，置-70 ℃冰箱保存备用，所获病毒命名为v?MSCV?2A,载体对照命名为v?MSCV,采用NIH3T3细胞测定重组逆转录病毒的滴度。
    1.3.4  病毒滴度的测定  制备含量为5×109/L的NIH3T3单细胞悬液，感染前1 d接种于6孔细胞培养板。24 h后细胞达40%～50%时吸去原培养基，加入不同稀释度的含体积分数0.05血清的病毒上清（从10-1开始倍比稀释至10-6）。每孔加polybrene(8 mg/L)作用3 h以降低膜表面电荷，促进逆转录病毒感染细胞，然后补加培养基3 mL至polybrene的终质量浓度为2 mg/L。继续培养48 h，使用 2.5 g/L 胰蛋白酶消化单层细胞，以1∶5传代至6孔板。24 h后加入含puromycin(10 mg/L)的选择性培养基，每2～3 d换液1次。5～6 d后，降低嘌呤霉素浓度（5 mg/L）继续维持培养，直到阳性克隆形成（约为2～3周），显微镜下进行计数。公式为：病毒滴度（CFU/mL）=平均抗性细胞克隆×稀释倍数×1 000。
    1.3.5  RT?PCR检测LMP2A的表达  分别提取转染重组质粒pMSCVpuro?2A和载体对照质粒的PT67抗性细胞克隆总RNA，用DNase消化处理排除DNA的干扰，RT?PCR扩增目的基因LMP2A。同时以DNase消化处理的RNA为模板进行PCR检测，证实RNA中确实无DNA污染,以EBV阳性的LCL作为阳性对照，PCR产物于12 g/L琼脂糖凝胶中电泳观察结果。
    2  结    果
    2.1  重组质粒pMSCVpuro?2A的鉴定
    EcoRⅠ和BglⅡ双酶切产物电泳可观察到约6.3 kb和1 500 bp的DNA条带；PCR扩增出大小约1 500 bp的条带，与预期结果相符，结果见图1。正反双向测序结果显示重组质粒目的基因插入方向正确，核酸序列准确无误，读码框架完整。
    图1  重组质粒pMSCVpuro?2A的鉴定
    ①:Marker DL15000;②:BglⅡ和EcoRⅠ双酶切重组质粒pMSCVpuro?2A;③:BglⅡ单酶切重组质粒pMSCVpuro?2A;④:阳性对照(EBV阳性LCL);⑤:pMSCVpuro?2A的PCR扩增产物;⑥:pMSCVpuro PCR扩增产物