2.3 对肺癌A549/DDP耐药细胞MRP mRNA和蛋白质表达的影响
2.3.1 半定量RT-PCR检测MRP mRNATRizol裂解培养的A549和A549/DDP细胞（DDP浓度为100 μmol/L），氯仿抽提，异戊醇沉淀，乙醇洗涤干燥获取总RNA，逆转录成cDNA，PCR扩增出MRP、内参β-actin基因片段。MRP引物序列参照文献［3］（上海博亚生物公司合成）：上游5'-GTA CAT TAA CAT GAT CTG GTC-3'，下游5'-CGT TCA TCA GCT TGA TCC GAT- 3'，扩增片段长度256 bp。反应条件：预变性94℃5 min进入循环，94℃变性30s，54.5℃退火30 s，72℃延伸60 s，共38个循环，最后72℃延伸5 min。内参β-actin基因引物序列（上海博亚生物公司合成）：上游5'-CAC ACG CAG CTC ATT G -3'，下游5'-AAG GAC TCC TAC GTT G -3'，扩增片段长度141 bp。反应条件：预变性94℃ 2 min进入循环，94℃变性30 s，54.1℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环，最后72℃延伸5 min。反应完成后取5μl IL-5 PCR产物，3 μl β-actin PCR产物及2 μl 5×上样缓冲液，加少量溴乙锭（EB）染色，行2%琼脂糖凝胶电泳。于紫外透射仪上观察电泳结果。用图像分析系统分别测每个目的基因及看家基因β-actin的吸光度（A）值，取目的基因与β-actin的A值比值即相对A值。
2.3.2 蛋白免疫印迹试验（Western Blot）检测MRP收集DDP浓度为100 μmol/L的肿瘤细胞，加入细胞裂解液，冰上放置15 min，12 000 r/min离心15 min，取上清，以Bradford法作蛋白质定量后置－80℃贮存备用。灌制10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶，常规电泳，转膜，封闭，一抗（1∶500），4℃孵育过夜，二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，ECL显色。图像经Uvp grabit Image软件测定各条带的吸光度，以各条带的吸光度值与β-actin吸光度值的比值进行细胞间蛋白表达量的比较。
2.4 统计学分析所有数据均用±s表示，使用统计软件SPSS13.0进行t检验分析。
3 结果
3.1 白花蛇舌草乙醇提取物对肺癌A549/DDP耐药细胞的耐药逆转作用MTT结果见表1，DDP对A549和A549/DDP细胞的抑制作用呈浓度依赖性。DDP对A549细胞的IC50为27.90 μmol/L，对A549/DDP细胞的IC50为287.19 μmol/L，A549/DDP的耐药倍数为10.294。而经过白花蛇舌草乙醇提取物（40 mg/ml）作用后的A549/DDP细胞DDP的IC50为155.85 μmol/L，耐药倍数为5.586。表1 不同浓度DDP作用72 h对A549和A549/DDP细胞的抑制作用（略）
3.2 白花蛇舌草乙醇提取物对肺癌A549/DDP耐药细胞MRP mRNA表达的影响A549/DDP细胞的MRP mRNA的表达（A值为1.025±0.133）显著高于A549细胞（A值为0.106±0.018）（P﹤0.01）；而白花蛇舌草乙醇提取物则使A549/DDP细胞MRP mRNA的表达明显减少（A值为0.537±0.062）（P﹤0.01），但仍高于A549细胞MRP mRNA的表达（P﹤0.01），如图1所示。
3.3 白花蛇舌草乙醇提取物对肺癌A549/DDP耐药细胞MRP 蛋白表达的影响Western Blot检测显示，A549/DDP细胞的MRP蛋白表达显著高于A549细胞的表达；白花蛇舌草乙醇提取物能够减少A549/DDP细胞MRP蛋白的表达。结果见图2。
4 讨论
肺癌化疗疗效的降低，主要是肺癌细胞对化疗药物产生耐药性所致，因此积极寻找有效的肺癌化疗耐药逆转的有效方法是肺癌治疗的研究热点。研究表明［4，5］，多种中药如鸦胆子油乳、苦参碱、姜黄素等具有不同程度逆转肿瘤多药耐药的作用。白花蛇舌草是临床广泛使用的抗肿瘤中药之一，现代研究表明［6～8］，其主要化学成分有熊果酸、免疫多糖、乌索酸、白花蛇舌草素等，这些主要的有效成分具有增强免疫活性、抗氧化和抗肿瘤活性。我们研究结果显示，A549/DDP细胞对DDP的耐药倍数为10.294，白花蛇舌草乙醇提取物（40 mg/ml）能够明显降低A549/DDP细胞对DDP的耐药性（耐药倍数由10.294下降至5.586），增敏倍数高达1.843倍。