fat1转基因小鼠的构建与鉴定

【摘要】  目的 构建和鉴定携带有外源fat?1基因的转基因小鼠。方法 将fat?1基因的cDNA与动物表达载体pEF?neo连接，构建pEF?fat?1重组质粒, 酶切、测序鉴定正确后，以显微注射法把线性化重组质粒注射到小鼠受精卵的雄原核中，并将受精卵移植到受体鼠的输卵管中产出转基因小鼠，通过PCR、Southern blot杂交等方法确立阳性整合有目的基因的G0代小鼠。结果 成功构建了pEF?fat?1重组质粒，将其显微注射到小鼠受精卵中，得到G0代小鼠，PCR、Southern blot杂交确立了4只整合有fat?1基因的首建鼠。结论 fat?1基因可整合到小鼠体内，得到的转基因小鼠为研究fat?1基因的生物学功能提供了动物模型。 
【关键词】  小鼠 转基因 DNA 重组 fat?1基因
［ABSTRACT］ObjectiveTo construct and identify the transgenic mice with extrinsic fat?1 gene. MethodsFat?1 cDNA and animal expression vector pEF?neo were conjugated to construct the recombinant plasmid pEF?fat?1 which was digested by restrict enzyme and sequenced correctly. The obtained linear recombinant plasmid pEF?fat?1 was microinjected into the arsenoblasts of mouse zygote, which was implanted into the uterus to produce transgenic mice. PCR and Southern blot were performed to identify the positive G0 generation of fat?1 transgenic mice. ResultsRecombinant plasmid pEF?fat?1 was successfully constructed and four G0 mice with integrated fat?1 gene were identified via PCR and Southern blot.ConclusionFat?1 gene can be integrated into mouse to obtain the transgenic mouse that provides an animal model for the study of fat?1 gene.
    ［KEY WORDS］mice, transgenic; DNA, recombinant; fat?1 gene
    fat?1基因来源于小秀丽线虫，SPYCHALLA等［1］利用在阿拉伯芥（Arabidopsis）中进行异种表达的方法确认了fat?1  cDNA的序列。此cDNA 的翻译产物是由402个氨基酸组成的n?3多聚不饱和脂肪酸（PUFAs）脱氢酶，相对分子质量为4.64万，是氧离子依赖的含铁酶，属于跨膜蛋白超家族。此酶的功能是以16～20碳的n?6 PUFAs为底物进行脱氢反应，生成相应的n?3 PUFAs。体外实验表明， fat?1 cDNA的表达可促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，保护神经细胞，并可改变细胞膜n?6/n?3 PUFAs的比例，降低来源于n?6 PUFAs的类花生酸的组成 ［2～7］。本文旨在构建和鉴定fat?1转基因小鼠，从而为fat?1基因在动物整体水平上的研究提供实验模型。
    1  材料和方法
    1.1  材料
    菌株XL1?Blue及pEF?neo质粒由中国科学院遗传与发育生物学研究所提供。pcDNA?fat?1质粒(内含fat?1 cDNA)由本室保存。各种限制性内切酶、DNA分子质量标准λDNA/EcoRⅠ+HindⅢ及T4 DNA连接酶等均购自Promega公司；PCR引物由上海生工公司合成，DNA测序由北京三博远志生物公司完成。琼脂糖购自华美生物工程公司。DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司。其他试剂均为国产分析纯。
    1.2  方法
    1.2.1  重组质粒pEF?fat?1的构建  pcDNA?fat?1及表达载体pEF?neo用EcoRⅠ/XbaⅠ进行双酶切，8 g/L琼脂糖凝胶电泳，分别回收、纯化1.3 kb片段和大片段。将1.3 kb的目的片段和载体片段以摩尔比3∶1连接，转化感受态大肠杆菌XL1?Blue后，用小量碱裂解法提取重组质粒。
    1.2.2  重组质粒pEF?fat?1的鉴定  据相应酶切图谱，上述提取的重组质粒分别用EcoRⅠ/XbaⅠ、BglⅡ、XhoⅠ进行酶切鉴定，将阳性重组子命名为 pEF?fat?1。